单细胞RNA测序技术在肿瘤免疫微环境研究中的应用

杨凯莉，孙 昭，白春梅，赵 林

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肿瘤内科，北京 100032

单细胞RNA测序指在单细胞的分辨率水平上进行RNA测序，检测细胞的基因表达水平。该技术一般流程可分为组织分离、单细胞捕获、细胞裂解、逆转录、扩增、文库构建、测序、数据分析这几个步骤[1]。当前主流的单细胞捕获技术为微流控平台[2- 4]，如Drop-seq、Chromium、InDrop等，其基本原理为在油包水的环境下，单细胞与包含特异寡核苷酸标签(barcode)的凝胶珠结合，给每个细胞带上不同的特异性序列，之后将液滴混合、裂解细胞并进行逆转录等后续步骤；该方法目前可进行高通量的单细胞测序，且所需成本较低[5]。微流控平台之外，单细胞捕获还包括显微操作[6]、流式细胞仪、激光捕获显微切割[7]等技术。当前主流的单细胞RNA测序方法包括CEL-seq2、Drop-seq、MARS-seq、Smart-seq2、SCRB-seq等，其中，Drop-seq分析大量单细胞的成本最低，Smart-seq2的测序灵敏度最高，SCRB-seq在对灵敏度和扩增误差的平衡性方面表现最好[5]。在进行单细胞RNA测序分析时，应根据实验目的采取最优的测序方法。在后续文库构建和数据分析等步骤，单细胞RNA测序与传统的测序方法(bulk sequencing)依据的原理和流程基本相同。任何组织，特别是肿瘤，其细胞组成都具有异质性。使用传统测序方法只能获取对大量细胞群体平均后的数据。与之相比，单细胞RNA测序具有最高的分辨率，可保留组织内异质性信息，以及部分罕见细胞群体的转录信息，供研究人员进行分析。自2009年研究人员首次在单细胞水平研究小鼠四细胞期卵裂球转录组状况[6]以来，单细胞RNA测序技术在研究神经生物学[8]、胚胎发育[3，9]、肿瘤[10- 11]等方面已经得到广泛的应用。

肿瘤是一个具有高度复杂性的整体，其发生、发展、转移等过程离不开与其所处微环境持续的相互作用。肿瘤浸润的免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，包括肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)、肥大细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、髓系抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)等亚群；这些免疫细胞一方面对肿瘤细胞起杀伤作用(如CD8+T细胞、NK细胞)，另一方面又表现出促进肿瘤发展的作用[12]。研究表明，肿瘤内浸润的免疫细胞可通过分泌生长因子[13]、帮助肿瘤细胞逃避抑生长因子[14]、抑制细胞凋亡[15]、促进血管生成[16]、促进肿瘤转移[17]、进行免疫抑制[18- 19]、改变能量代谢[20]等途径起到促进肿瘤发展的作用。鉴于其在肿瘤进展中的重要作用，当前肿瘤免疫微环境已成为重要的治疗靶点。以解除微环境内对CD8+T细胞的免疫抑制为例，使用抗体阻滞细胞毒性T淋巴细胞相关抗原- 4(cytotoxic T lymphocyte antigen- 4，CTLA- 4)、程序性死亡受体- 1(programmed cell death- 1，PD- 1)的免疫药物已经上市，且在对黑色素瘤[21]、淋巴瘤[22]、Merkel细胞癌[23]等肿瘤的治疗上取得显著的成效，这充分表明免疫治疗具有良好前景。然而，在结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌患者，特别是微卫星序列稳定的患者中，PD-L1疗法却几乎没有表现出客观疗效[24- 25]，这说明我们当前对肿瘤免疫微环境的认知仍极其有限。因而，为开发更加有效、精准的免疫治疗方案，研究人员需要进一步描述和阐明肿瘤免疫微环境的组成。单细胞RNA测序技术在单细胞的分辨率下揭示细胞所处的功能状态，是研究肿瘤免疫微环境的有力工具，本文总结了单细胞RNA测序技术在肿瘤免疫微环境研究中的应用进展。

刻画肿瘤免疫微环境的组成

肿瘤免疫微环境由许多不同种类的细胞组成，具有高度异质性，不同类型细胞对肿瘤发展起到不同作用。传统的RNA测序方法只能获得混杂大量不同种细胞内基因表达信息平均后的结果，不能有效识别和描述肿瘤免疫微环境中存在的不同细胞种类及其所处状态。单细胞RNA测序可以克服该障碍，并且基于单细胞水平，准确识别微环境中不同免疫细胞类群及可用于特征性描述该类细胞的生物标志物，进而揭示其在发育和功能上所处的状态。

单细胞RNA测序可以特异性识别肿瘤微环境中某一类细胞及其对应的基因表达特征。Tirosh等[26]对来源于15个黑色素瘤的2068个T细胞进行单细胞转录组测序，得到的T细胞耗竭特征性基因中，TIGIT、TNFRSF9/4- 1BB、CD27等28个基因在多种肿瘤耗竭性T细胞中也存在表达上调，具有普适性描述肿瘤中耗竭性T细胞的价值。Zheng等[27]对来源于6个未经治疗肝癌患者的肿瘤、外周血和正常组织的5063个T细胞进行测序，识别出LAYN、PHLDA1、SNAP47等全新的T细胞耗竭特征性基因，这些基因尚未在已有文献中进行报告。Lavin等[28]利用单细胞RNA测序分析18个肺腺癌患者的肿瘤免疫微环境，同样得到TREM2、CD81、MARCO、APOE等肿瘤浸润巨噬细胞的特征性基因。

除特异性描述某类免疫细胞特征外，单细胞RNA测序数据可从整体视角提供肿瘤免疫微环境的细胞组成及分布特点。Azizi等[29]对来源于8个乳腺癌样本及正常乳腺组织、血液和淋巴结的47 016个CD45+细胞进行单细胞RNA测序，获得83个细胞类群，其中14个髓样细胞类群和17个T细胞类群是肿瘤组织特有，说明相比正常组织，肿瘤微环境中免疫细胞发生表型扩张。Darmanis等[30]对来自4个恶性胶质瘤患者的肿瘤核心和周围区域共3587个细胞进行单细胞RNA测序，发现肿瘤核心集中分布巨噬细胞、高表达抗炎症基因和促血管生成因子，如抗炎症调节物白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin 1 receptor antagonist，IL1RN)；与此对比，周围区域主要富集小胶质细胞、高表达促炎症基因，如炎症标志物白细胞介素1α/β(interleukin 1α/β，IL1α/β)。这说明在肿瘤免疫微环境内，不同免疫细胞类群对肿瘤浸润及基因表达具有空间特异性。

描述肿瘤免疫微环境内细胞的发育路径

肿瘤免疫微环境中存在不同种类、不同状态的免疫细胞，细胞不同状态间往往存在发育上的相互转化，进而导致肿瘤的免疫抑制等后果。通过单细胞RNA测序，研究人员可以对比不同细胞类群间的状态差异，描述肿瘤免疫微环境中细胞的发育路径，阐明该现象的潜在机制。

肿瘤免疫中，CD8+效应T细胞起到重要的抗肿瘤作用，但肿瘤介导的T细胞耗竭阻碍CD8+T细胞正常发挥细胞毒性，从而导致免疫抑制[31]。研究肿瘤浸润T细胞表型的转换机制，特别是正常发挥功能的效应T细胞转化为耗竭性T细胞的过程，有利于更深入地了解对肿瘤的免疫抑制机制，并为肿瘤的免疫治疗发现潜在靶点。Azizi等[29]对乳腺癌免疫微环境内不同T细胞类群的主成分分析揭示，T细胞处在连续活化和分化轨迹中，其表型多样性由各环境刺激因素和T细胞受体(T cell receptor，TCR)共同决定。根据单细胞RNA测序结果及单细胞对应的TCR序列，Zheng等[27]采用Monocle 2算法[32]分析T细胞的发育轨迹，发现CD8+T细胞存在从活化到耗竭的状态转变过程，且GZMK+亚群是该转变过程的中间态。Guo等[33]采用相同算法分析非小细胞肺癌患者的12 346个T细胞单细胞测序数据结果，显示LAYN+、CX3R1+的T细胞类群处于对立的发育终末状态，而CD28+、GZMK+、ZNF63+类群是处于功能上过渡态的细胞类群。研究人员进一步考虑这些细胞类群对T细胞耗竭特征基因相对较低的表达，定义它们为耗竭前细胞。此外，当T细胞识别肿瘤受体后，会产生一系列具有相同TCR的子细胞，这些相同的TCR称为TCR克隆型，该增殖过程称为T细胞克隆性增殖[34]。Tirosh等[26]通过测定与单细胞对应的TCR数据，并根据TCR克隆型来划分T细胞类群，发现未耗竭的CD8+T细胞大多是未增殖细胞，即未耗竭的T细胞克隆型增殖能力较低，说明T细胞克隆性增殖与T细胞耗竭存在一定相关性。

髓样细胞是除淋巴系细胞外肿瘤免疫微环境内的另一重要成分，其中TAM占髓样细胞的绝大多数。TAM存在2种主要的功能状态，包括传统的促进炎症反应、抑制肿瘤发展的M1和促进肿瘤发展和转移的M2[35]。研究巨噬细胞功能状态的调控机理，同样有利于理解肿瘤的免疫抑制机制并指导相关靶向治疗。Lambrechts等[36]对非小细胞肺癌来源免疫细胞的单细胞测序结果显示，肿瘤浸润的M1与M2型巨噬细胞间也存在渐进式的发育转化过程，且在TAM中上调表达的干扰素调节因子(interferon regulatory transcription factor，IRF)2、IRF7、IRF9、信号传导及转录激活蛋白2(signal transducer and activator of transcription 2，STAT2)等转录因子可能是TAM向M2分化的潜在原因。Muller等[37]对胶质瘤患者TAM的单细胞测序结果中，66%的TAM对M1标志物TNF-α与M2标志物IL10呈现较高的共表达水平。Azizi等[29]针对乳腺癌中TAM进行测序，发现部分细胞类群同时高表达M1特征基因(如CCL3)和M2特征基因(如MARCO、NRP2)，两不同细胞类群特征基因的表达在髓样细胞中也呈正相关关系。这些结果提示TAM在肿瘤微环境中的分化也是一个连续递进的过程，而不是传统理论一贯认为的两个分立的离散状态。

研究肿瘤免疫抑制的分子机制

耗竭性T细胞和M2表型巨噬细胞是肿瘤发展中两类重要的免疫抑制性细胞类群。包括这两者在内，细胞隐藏在免疫抑制这一功能状态下的分子机制仍需得到进一步阐明。通过单细胞RNA测序，研究人员可获得特定功能状态下细胞类群对应的基因表达状态，进一步揭示细胞内发生的相关事件及其分子机制，特别是肿瘤的免疫抑制事件。

Nirschl等[38]检测淋巴结转移黑色素瘤微环境中树突状细胞和单核细胞的转录组，发现这两种细胞对机体免疫稳态相关的基因表达上调，且干扰素γ(interferon γ，IFNγ)可诱导其表达，说明肿瘤可能利用机体调控自身免疫稳态的机制进行免疫逃逸。此外，该项研究进一步揭示IFNγ在肿瘤发展中起双向作用，既使T细胞和NK细胞发挥细胞毒性作用，又诱导髓样细胞发生免疫抑制。

Singer等[39]发现金属硫蛋白基因敲除鼠黑色素瘤模型中，CD8+T细胞的活化能力不变，且抗肿瘤能力增加，表明肿瘤对CD8+T细胞的抑制功能很可能被解除。研究人员使用单细胞RNA测序技术分析野生型与基因敲除鼠中共1061个肿瘤浸润T细胞，结果发现与基因敲除鼠相比，野生型小鼠中存在特定的细胞类群，它们高表达一类T细胞功能障碍相关的基因。这提示基因组中存在与T细胞活化相独立的T细胞失活基因模块，且金属硫蛋白可诱导其表达，从而诱导T细胞发生功能障碍。

肿瘤微环境中靶向细胞自噬同样是一种免疫疗法。Cunha等[40]发现干扰髓样细胞中LC3相关的吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)可以促进TAM的吞噬作用，有效抑制肿瘤生长。单细胞RNA测序结果进一步揭示其分子机制，LAP被敲除的髓样细胞中，促炎症基因与STING介导的Ⅰ型干扰素反应特征基因表达上调，说明LAP通过抑制TAM的Ⅰ型干扰素反应，参与肿瘤的免疫抑制过程，促进肿瘤的发展。

分析外在因素对肿瘤免疫造成的影响

肿瘤是一个复杂的整体，无论是癌变发生组织、肿瘤微环境成分还是肿瘤进展的临床分期，都会影响肿瘤的免疫浸润状态。传统测序方法难以分辨肿瘤微环境中包含的各细胞成分，而单细胞测序技术可以区分各细胞类群，并对各外在因素对肿瘤免疫微环境造成的影响进行详尽分析。

肿瘤所处的微环境除免疫细胞外，还存在肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)、血管内皮细胞、细胞外基质等非免疫细胞成分，它们同样会影响肿瘤免疫微环境的功能状态，使用单细胞RNA测序技术可高分辨率地阐明肿瘤微环境中存在的这种复杂的相互作用。Tirosh等[26]结合单细胞数据与TGCA数据库，发现了一系列与T细胞浸润具强相关性的由CAF表达的基因，包括趋化因子配体2(C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2)、趋化因子配体19(C-C motif chemokine ligand 19，CCL19)等化学趋化因子和免疫调控基因如PD-L2，且补体因子3与CD8+T细胞的浸润具有强相关性，证明CAF很可能参与调控T细胞的肿瘤浸润。Lambrechts等[36]测序结果显示，相比正常细胞，非小细胞肺癌微环境中，肿瘤内皮细胞显著下调抗原呈递相关(MHC Ⅰ&Ⅱ)、化学趋化(CCL2、CCL18、IL6)、免疫细胞归巢(ICAM1)等信号通路。众所周知，内皮是循环的免疫细胞和肿瘤接触的第一道屏障，在传递信号、呈递抗原表位方面发挥重要作用[41]，因此肿瘤内皮细胞很可能发生重构，其免疫刺激功能被抑制，进而导致肿瘤的免疫耐受。

使用单细胞RNA测序技术还可以分析同一类型肿瘤的不同临床分期之间免疫微环境的异同，阐明肿瘤进展过程中免疫微环境内发生的一系列动态变化。Lavin等[28]分析来自18个肺腺癌患者的样本，发现针对肿瘤免疫微环境的组成，与早期肺腺癌TNM分期Ⅰ期患者相比，Ⅱ、Ⅲ期除患者嗜中性粒细胞占比升高、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)表达升高外，巨噬细胞、淋巴细胞等不同细胞类群占比并未随肿瘤分期发生显著变化。此外考虑细胞表面分子的表达状况，不同TNM分期中PD- 1、PD-L1在巨噬细胞和T细胞中的表达水平也都相同，提示针对晚期肿瘤的免疫疗法也可作用于肿瘤早期。Bernard等[42]检测胰腺导管腺癌及其早期病变导管内乳头状黏液瘤的免疫微环境，发现在病变由低等级乳头状黏液瘤转化为胰腺导管腺瘤的进展过程中，肿瘤微环境内细胞毒性T细胞逐渐丧失，而具有免疫抑制特性髓系抑制细胞则发生累积。

发现潜在的免疫治疗靶点

现有的免疫疗法在部分肿瘤患者的治疗中已取得成果，显示针对肿瘤免疫微环境而不是肿瘤本身进行治疗，同样可以取得良好的抗肿瘤效果。单细胞RNA测序技术可以进一步描述肿瘤免疫微环境中各细胞类群所处的功能状态，为抗肿瘤提供新的治疗靶点。

可作为潜在免疫治疗靶点的包括与T细胞的耗竭显著相关的一系列蛋白分子或转录因子，如T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte-activation gene 3，LAG3)[43]、活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATC1)[26]、胰岛素样生长因子家族受体1(insulin growth factor-like family receptor 1，IGFLR1)[44]。此外，单细胞RNA测序阐明了某些细胞类群的特征，这些细胞类群也可能是潜在的治疗靶点。如前文所述，效应T细胞与耗竭性T细胞并非两个离散的状态[27，29]，两者间存在CD28+、GZMK+、ZNF63+等耗竭前细胞类群[33]，阻止耗竭前细胞向耗竭性T细胞的转化即为一潜在治疗方向。现有条件下，PD- 1疗法治疗微卫星序列不稳定(microsatellite-instable，MSI)患者的效果优于微卫星序列稳定(microsatellite-stable，MSS)患者。Zhang等[43]分析包含MSI和MSS患者在内12例结直肠癌患者的肿瘤浸润T细胞，发现两个IFNG+辅助T细胞(helper T，Th)样类群，包括GZMK+亚群和CXCL13+亚群，显示CXCL13+亚群富集于MSI患者中，而MSS患者中富集Th17细胞类群，且两细胞类群存在发育上的相关性，阻滞这两类细胞间的转化是一个潜在的治疗策略。Muller等[37]对胶质瘤来源TAM的研究显示，在胶质瘤中富集的2种TAM中，巨噬细胞高表达一系列和M2相关的基因，且与更短的存活时间相关，而小胶质细胞中则不存在这种现象，这提示恶性胶质瘤治疗中针对TAM免疫治疗应进一步区分细胞子类，靶向巨噬细胞而非小胶质细胞。

预测不同类型肿瘤免疫微环境对应的预后

单细胞RNA测序数据具有巨大的信息量，除使用特定的生物信息工具进行分析外，还可利用单细胞测序数据确定的细胞类群、特征基因等信息来分析TCGA等已有的传统测序数据库，获取不同肿瘤微环境对应的临床预后等信息。

Muller等[37]根据5455个恶性胶质瘤浸润TAM的单细胞转录组测序数据，获得用于鉴别胶质瘤TAM中巨噬细胞和小胶质细胞的66个特征基因。将这套基因应用到TCGA数据库进行检验，发现巨噬细胞在恶性胶质瘤中的浸润水平显著高于低级别胶质瘤，而对于小胶质细胞不存在此关联。此外，巨噬细胞特征基因的表达还与低级别胶质瘤的存活时间呈负相关。Guo等[33]根据其单细胞测序中得到的细胞类群标志物GZMK与CTLA4对TCGA中肺腺癌患者进行分类，发现与富集耗竭前CD8+T细胞(特征为GZMK+)和非活化调节性T细胞(regulatory T cell，Treg，特征为TNFRSF9-)的患者相比，富集耗竭T细胞(特征为LAYN+CXCL13+)和活化Treg(TNFSR9+)的患者预后较差，肿瘤免疫微环境中T细胞的组成可有效预测患者预后。

总结与展望

单细胞RNA测序技术可帮助研究人员在更高分辨率水平下对肿瘤免疫微环境进行研究，包括精确刻画其各细胞类群及相应的转录特征；描述微环境内免疫细胞的发育轨迹；研究肿瘤免疫抑制的分子机制；分析外界因素对肿瘤免疫产生的影响；发现临床上新的免疫治疗靶点；以及分析不同类型肿瘤患者的生存预后(图1)。

虽然单细胞RNA测序技术极大推动了当前对肿瘤免疫微环境的研究，但综合考虑现有的一些研究成果，该技术的应用仍存在一定限制。

首先，依托技术的快速发展，研究人员从单细胞RNA测序中获取的信息量堪称庞大，而如何有效解读、利用这些信息是一个至关重要的问题。一种思路是将单细胞测序获取的结果(如一些特征性的基因)与已有数据库如TCGA结合，进行进一步的信息挖掘；此外，当前针对单细胞测序数据开发出的一些全新的生物信息学方法，也有助于对单细胞测序数据的进一步解读[44- 45]。

其次，综合前文内容可见，当前使用单细胞RNA测序得到的大多是一些描述性的结果，且许多数据具有较强的患者特异性，如何获取一些普适性的、具有临床转化和应用价值的结论仍需要进一步的探讨。从这方面来讲，研究人员应与临床医生进行进一步的沟通，根据特定临床问题更有针对性地选择测序的样本。

图1单细胞RNA测序技术在肿瘤免疫微环境研究中的应用概览
Fig1Application of single-cell RNA sequencing in research on tumor immune microenvironment

Zhang等[43]以免疫治疗耐药性为出发点，针对MSI和MSS结直肠癌患者肿瘤免疫微环境的研究即具有较高的临床价值。

此外，肿瘤进展的过程中，遗传信息的复制、转录、翻译都发生相当大的变化。然而，单细胞RNA测序技术只能获取单细胞转录组层面的信息，仍具有一定的局限性。当前单细胞多组学测序技术蓬勃发展[46]，单细胞DNA与RNA测序技术的结合已用于研究肿瘤在患者体内的演化机制[47]。因而，可以断言单细胞RNA测序技术与单细胞基因组学、蛋白组学、表观遗传学测序技术将进一步结合，辅助肿瘤免疫微环境的研究取得更多进展。