寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展

王泽祥，孙晓林

（甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070）

20世纪60年代，美国加利福尼亚大学的学者从鸡蛋清中首次分离出半胱氨酸蛋白酶抑制剂，随着研究的不断深入，科学家发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一类在进化相关的蛋白质，能够抑制C1家族蛋白、C13家族蛋白、木瓜蛋白酶类的半胱氨酸蛋白酶[1]。1991年，Lustigman等人首次在寄生虫—旋盘尾线虫中发现了半胱氨酸蛋白酶抑制剂的存在，并对其进行成功克隆和鉴定[2]。随后的数十年间，吸虫、绦虫、线虫和原虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂不断被发现，其类型、结构及生物学功能的研究也逐渐深入。本文对吸虫、绦虫、线虫和原虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂研究的进展进行综述。

1 寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分类与结构

1.1 分类和结构

适用于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的分类方式有两种，第一种分类方式是根据半胱氨酸蛋白酶抑制样特征的有无进行分类（如二硫键、半胱氨酸蛋白酶抑制样元素的数目），第二种分类方式是根据氨基酸序列和一级结构特征进行分类[3]，是目前半胱氨酸蛋白酶抑制剂常用的分类方式[4]。依据第二种分类方式，将半胱氨酸蛋白酶抑制剂分为四个亚家族，分别是stefins家族、cystatins家族、kininogens家族和fetuin家族[5]。

Stefins家族亦称为胱抑蛋白，是一条约100个氨基酸的多肽链，分子量大约11 kDa，无信号肽序列、二硫键和糖基。该家族蛋白主要存在于细胞内，在细胞外液中有少量存在。Stefins家族包括stefin A和stefin B两个成员，stefin A主要分布在各种上皮细胞和中性粒细胞中，而stefin B则在各类细胞和组织中普遍分布[6，7]。

Cystatins家族蛋白的多肽链约包含120个氨基酸，分子量大约为13～15 kDa，有一个信号肽序列和2个二硫键位于多肽链的N端。除此之外，在cystatins的N端有一个保守的甘氨酸、残基和QxVxG基序，而在C端则有保守的PW序列，这三者形成的疏水性契形结构形成了cystatin抑制半胱氨酸蛋白酶的活性部位。部分cystatins还有一个SND/S保守序列位于N端甘氨酸和QxVxG之间，可能是这类cystatins抑制豆荚蛋白水解酶的活性部位。Cystatins家族蛋白是分泌型蛋白，主要分布于动物的体液中[8，9]。

Kininogens家族蛋白是单链蛋白质，分子量较大，60～120 kDa之间均有分布，有信号肽序列、多个糖基化位点和二硫键，序列中含有串联的cystatins样的结构域。Kininogens家族包括H-Kininogen、L-Kininogen和T-Kininogen 3个成员。H-Kininogen分子量最大，约120 kDa，而L-Kininogen和T-Kininogen分子量相近，均为68kDa左右。Kininogens家族成员氨基酸单链N端结构均比较保守，而C端结构差别较大。H-Kininogen、L-Kininogen和T-Kininogen均含有数目不等的蛋白酶敏感的结构域，H-Kininogen和L-Kininogen在N端有3个蛋白酶敏感的结构域，而T-Kininogen中，除了在N端有3个蛋白酶敏感的结构域，在C端也有一个蛋白酶敏感的结构域。Kininogens家族多分布于体液中，主要是血浆和分泌液中[10-12]。

fetuin家族只有部分成员具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，该家族蛋白由Elzanowski等人于1988年发现，因其具有cystatin样的结构域，故将其与cystatin家族联系在一起，归类为第四家族。该家族蛋白亦是分泌蛋白，属于I25C亚家族[13-15]。

1.2 功能

在宿主特异性T 细胞免疫应答的抗原降解和抗原肽-主要组织相容性复合体的形成两步催化反应过程中，半胱氨酸蛋白酶发挥着关键的作用，一方面参与抗原提呈细胞（APC）核内体-溶酶体内抗原的处理，另一方面水解与MHC-Ⅱ分子结合的恒定链，以形成与MHC-Ⅱ分子结合的恒定链肽段，从而便于MHC-Ⅱ分子的肽结合凹槽暴露，助于处理的抗原多肽与MHC-Ⅱ分子的结合。寄生虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂能够抑制宿主的半胱氨酸蛋白酶，干扰抗原的处理，阻断肽段与MHC-Ⅱ分子的结合，以降低APC抗原提呈的功能[5,16-19]。

宿主免疫反应中会产生促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子、NO等效应分子调节机体免疫系统。寄生虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂不但具有调节细胞因子生成量、诱导抗炎症反应、转变无保护性免疫应答的能力，而且具有影响宿主NO释放量的免疫调节功能[5,20-24]。

寄生虫的免疫逃避是其在宿主体内寄生、增殖的重要机制，寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的产生是寄生虫适应寄生虫-宿主共进化和逃避宿主免疫应答的方式之一。这不但表现在一些寄生虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂对宿主蛋白酶的高特异性方面，而且表现在抑制蛋白酶活性、影响免疫细胞增生及调节细胞因子表达量方面[5,22,25]。

2 寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂研究现状

2.1 吸虫

肝片吸虫的3种半胱氨酸蛋白酶抑制剂都属于stefin亚家族，其中FhStf-1是经典的stefin家族半胱氨酸蛋白酶抑制剂，由于FhStf-2和FhStf-3二者均包含不常见的信号肽序列，被归类为stefin亚家族仍存在一定异议。研究发现，重组表达的肝片吸虫的FhStf-1、FhStf-2和FhStf-3都能够抑制肝片吸虫的组织蛋白酶L，然而，三者抑制哺乳动物组织蛋白酶B、L和C的能力则存在差异。FhStf-1主要分布在肝片吸虫的生殖器官（如睾丸和卵巢）和成虫肠腔薄膜表面，据此可以推断FhStf-1可能调节肝片吸虫生殖和消化相关的半胱氨酸蛋白酶活性。此外，在肝片吸虫的排泄分泌物中也发现了FhStf-1的分布，这表明FhStf-1是通过非经典分泌途径分泌的，而且其可能与宿主细胞溶酶体的半胱氨酸蛋白酶产生相互作用[26]。日本血吸虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂与曼氏血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的序列相似性达到77%，生物信息学发现其无信号肽序列和二硫键，由此可以推断它是属于stefins家族。在日本血吸虫虫卵、童虫和成虫阶段均有该半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达，而且在虫卵的毛蚴中、成虫的肠道表皮和体表分布较多。实验研究证实，重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以进入小鼠树突状细胞中，但是仅分布在树突状细胞的胞浆中，其能够抑制小鼠树突状细胞的活性和代谢水平，继而降低小鼠树突状细胞对抗原的递呈作用。更重要的是，重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以显著提高感染小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+免疫调节性T细胞的比例，由此可以得出：日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有抑制抗原递呈及诱导抑制性免疫反应的功能，它可能在血吸虫免疫逃避中发挥作用[27]。

2.2 绦虫

目前发现的猪带绦虫的两种半胱氨酸蛋白酶抑制剂分别属于stefin和cystatin两个亚家族成员，而且两者在猪囊尾蚴和成虫期都有转录和表达，而且成虫期的表达量远高于猪囊尾蚴时期的表达量。李君君等人对猪带绦虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ts-stefin和Ts-cystatin进行了可溶性原核表达和纯化，酶活性抑制试验结果显示两者对人源组织蛋白酶L和牛源组织蛋白酶B的活性均有明显抑制功能[28]。制备Ts-cystatin多克隆抗体，运用免疫组织化学方法对Ts-cystatin在猪带绦虫成虫成熟节片中的分布进行了定位研究，发现Ts-cystatin主要分布在成熟节片的体壁、间质和卵巢中。吴茂迪等人对细粒棘球绦虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Eg-cystatin进行了克隆和生物信息学分析，显示Eg-cystatin含有cystatin结构域、Q-X-V-X-G保守序列、甘氨酸残基和PW发夹环结构，Eg-cystatin与猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫的cystatin序列相似性约为72.20%～75.91%，进化树上它们属于同一分支。免疫荧光定位显示原头蚴Eg-cystatin的分布区域主要是表皮及顶突小钩、生发层，而成虫Eg-cystatin的分布区域主要是虫体内部和虫卵[29]。

2.3 线虫

许多线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂都得到了不同程度的研究，丝虫、巴西日圆线虫和捻转血矛线虫的cystatin都被证明具有抑制宿主组织蛋白酶的活性。马兰丝虫表达3个cystatins，而且它们进行期特异性表达，其中Bm-cystatin-2在马兰丝虫的整个生命周期都进行表达，而Bm-cystatin-1和Bm-cystatin-3仅在媒介蚊子的晚期表达，在宿主哺乳动物时期则不进行表达[30]。许多线虫的cystatin都可以干扰宿主抗原递呈的过程，如马兰丝虫、棉鼠线虫和巴西日圆线虫。旋盘尾丝虫的cystatins能够降低外周血单核细胞表面分子白细胞分化抗原HLA-DR和CD86的表达量，这说明线虫的cystatins也是一种调节单核细胞活性的因子[31]。此外，魏氏棘唇线虫、捻转血矛线虫和小鼠肠道寄生线虫的cystatin通过调节宿主细胞因子的表达，为自身逃避宿主免疫应答提供便利。李婷婷等人对旋毛虫的3种半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行了深入研究，发现3种Stefin、Cystatin1和Cystatin2在旋毛虫的肌幼虫、成虫和新生幼虫时期都发生转录，而它们的表达则主要在肌幼虫的表皮和杆状体中。重组的旋毛虫cystatins和IFN-γ共同作用于巨噬细胞RAW264.7，具有明显剂量依赖性抑制巨噬细胞NO产生的作用[6]。此外，与许多线虫类似，旋毛虫cystatin同样具有调节巨噬细胞分泌细胞因子的功能，重组的cystatin单独作用于巨噬细胞，能够促进IL-10的分泌。

2.4 原虫

目前，锥虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂研究最为深入，克氏锥虫和布氏锥虫中均存在cystatin类似蛋白chagasin，该蛋白具有抑制木瓜蛋白酶（C1）家族半胱氨酸蛋白酶活性的功能。研究表明，克氏锥虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂能够与半胱氨酸蛋白酶cruzain紧密结合，继而该病半胱氨酸蛋白酶cruzain在虫体的定位，这种定位的改变主要发生在高尔基体，而且Cystatins能够上调克氏锥虫感染后小鼠巨噬细胞NO的分泌量[32，33]。诱导墨西哥利什曼原虫和硕大利什曼原虫中也表达chagasin，重组表达的chagasin能够抑制CA半胱氨酸蛋白酶和C1半胱氨酸蛋白酶，但是不能够抑制CD半胱氨酸蛋白酶。阿米巴原虫的含有2个编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因，ICP1主要分布在细胞质，而ICP2主要分布在吞噬体，两者的晶体结构显示它们3个保守环形成的柔性契形结构可能是抑制半胱氨酸蛋白酶活性的区域[34]。此外，阿米巴原虫内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂CPI1的差异性表达会影响其与细胞外基质蛋白的结合，说明ICP1是调节阿米巴原虫与宿主蛋白质结合的重要因素，而且ICP1在阿米巴原虫的致病过程中发挥重要作用[35]。

3 结语

半胱氨酸蛋白酶抑制剂在吸虫、绦虫、线虫、原虫中广泛存在，具有独特的酶抑制活性和免疫调节功能，调节宿主免疫系统的抗原递呈，调节细胞因子的表达量、调节巨噬细胞NO的合成量等。对寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行基因克隆、序列分析和功能研究有助于在分子水平上阐明寄生虫免疫调节和免疫逃避的机制，而且半胱氨酸蛋白酶抑制剂在抗寄生虫感染中的应用前景也在不断扩展。目前，半胱氨酸蛋白酶在寄生虫领域的研究已经取得了一些进展，但是很多寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究依然局限在序列分析和虫体定位方面，有必要对它们的功能进行深入的研究。相信随着研究工作的不断深入，寄生虫半胱氨酸酶抑制剂的功能和应用方面的研究会有新的突破，对寄生虫免疫调节和免疫逃避的机制的了解也会越来越清楚。