卵母细胞线粒体DNA与胚胎质量的相关性研究进展

张敏，杜馨，李贝贝，姜宏

胚胎的线粒体全部来源于卵母细胞，卵母细胞质量决定了胚胎的发育潜能。卵母细胞质量低下的因素主要包括遗传、高龄、超排卵、免疫和代谢等。近年，线粒体功能改变对卵母细胞及胚胎质量的影响备受关注。有研究表明，线粒体基因缺陷或表达降低[1]及线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变累积[2]均可导致线粒体功能障碍和ATP产生减少，从而影响卵母细胞质量、受精及胚胎的发育潜能。胚胎植入前遗传学检查（preimplanation genetic testing，PGT）的广泛应用虽明显降低了遗传学异常胚胎的移植率，改善了辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的临床结局，但并不能改善患者的卵母细胞质量，且PGT的常规使用仍存在争议。因此，进一步阐明mtDNA与胚胎质量之间的关系，对改善胚胎质量及ART妊娠结局具有重要意义。本文主要综述mtDNA的特点及与胚胎质量的相关性。

1 MtDNA的结构特点

MtDNA是位于线粒体内膜上的闭合环状双链DNA分子，全长16 569 bp，其内、外侧链（分别称为轻链、重链）均具有编码功能。人mtDNA由一个编码区和一个非编码区（又称D-loop区）组成。编码区位于nt577-nt16023，重链编码28个基因，轻链编码9个基因，其中包括2个核糖体RNA（rRNA）基因、13个氧化磷酸化系统相关基因和22个转运RNA（tRNA）基因。线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）依赖于5种多酶复合物的活性，复合物Ⅰ～Ⅳ构成电子传递链，复合物Ⅴ即ATP合酶，产生细胞能量合成所需的ATP。13个编码线粒体呼吸多肽链的基因中，7个为复合物Ⅰ的亚基（ND1，ND2，ND3，ND4L，ND4，ND5和ND6），1个为复合物Ⅲ的亚基（cytochrome b，cytb），3个为复合物Ⅳ的亚基（COⅠ，COⅡ和COⅢ），2个为复合物Ⅴ的亚基（ATP6 和ATP8）。D-loop区位于nt16024-nt576，长1 122 bp，是mtDNA重链和轻链的启动子区域。MtDNA 复制起始点和转录启动子均位于此区。D-loop区是mtDNA变异的热点区域，包含3个高突变区域（HVRⅠ：nt16024 -nt16383，HVR Ⅱ ：nt57 -nt372，HVR Ⅲ ：nt438-nt576）和一个周边区（nt16384-nt56，nt373-nt437）。MtDNA的基因结构与核基因组明显不同，全部为外显子，无内含子，使得大多数突变发生在编码序列中，更容易出现其编码RNA及蛋白异常，从而导致生物学上的后果。此外，mtDNA是裸露的，缺乏组蛋白的保护和mtDNA聚合酶γ的校对能力，且邻近产生大量氧自由基的电子传递链，更容易受到损伤[3]。因此，mtDNA突变是造成线粒体结构和功能异常并影响细胞活性的主要原因。

2 MtDNA拷贝数与胚胎质量

不同类型细胞中mtDNA拷贝数存在差异，成熟卵子的mtDNA含量明显多于体细胞。原始生殖细胞中含有约200个mtDNA拷贝数，随着卵子发生，线粒体数量和mtDNA拷贝数均逐渐增加，至卵子成熟完成受精时mtDNA拷贝数达到峰值。在囊胚阶段，总体mtDNA拷贝数逐渐减少，但与内细胞团相比，滋养外胚层中细胞的mtDNA拷贝数显著增加，而内细胞团则维持低水平的mtDNA复制。囊胚期内细胞团的mtDNA拷贝数及代谢活动低于滋养外胚层可能与胚胎种植有关[4]。

MtDNA拷贝数变异的机制与遗传、缺氧等线粒体微环境变化有很大关系。有研究发现，不同患者间及同一患者不同卵细胞内的线粒体拷贝数存在高度异质性，因此不同卵母细胞、胚胎的发育潜能也不尽相同[5]。受精失败或退化的卵母细胞的mtDNA拷贝数明显低于成功受精的卵母细胞[6]，且早期胚胎及发育阻滞的受精卵均存在线粒体分布、结构异常及mtDNA含量降低等现象[7]。然而，在不同的研究中存在许多差异，结果相互矛盾，这可能与许多混杂变量有关。近年研究显示，高龄、非整倍体和植入潜能较差的囊胚中，mtDNA拷贝数显著增加，mtDNA拷贝数显著升高的胚胎均种植失败[8-10]，与卵母细胞及卵裂期胚胎的研究结果相反。因此，有学者认为高水平的mtDNA仅能反应卵母细胞质量及胚胎早期的发育潜能，在胚胎后期（囊胚期）较高水平的mtDNA可作为线粒体异常激活的证据，可能与胚胎发育异常或线粒体功能不足代偿性增加有关[11]。在染色体异常及植入潜能较差的胚胎中观察到的mtDNA水平异常升高可能是胚胎的应激性反应，可作为胚胎发育异常的标志[8]。

人类卵母细胞及胚胎珍贵，且来源有限，难以用于科学研究，寻找无创的胚胎发育潜能生物学标志具有重要的临床应用价值。目前研究主要聚焦于卵母细胞及胚胎培养液、颗粒细胞、卵丘细胞等。有研究发现，胚胎培养液中mtDNA与基因组DNA比值（mtDNA/gDNA）与胚胎发育潜能相关，认为其可作为胚胎发育潜能的预测指标[12]。卵丘颗粒细胞（cumulus granulosa cells，CGCs）线粒体作为细胞能量代谢途径的中心细胞器，直接参与了胚胎上游的卵子发生过程[11]，是评估卵母细胞质量的最佳的非侵入性方法。有研究发现，猪卵母细胞中的mtDNA含量与其CGCs的mtDNA含量相关，CGCs的mtDNA含量增加有助于卵母细胞及胚胎的正常发育[13]。在卵母细胞成熟的不同阶段，CGCs的mtDNA可进行自我降解和复制，以满足相应卵母细胞的能量需求和卵母细胞细胞质的成熟[14]，且CGCs mtDNA的拷贝数与胚胎质量及胚胎植入潜能均呈正相关[11,15]，是体外受精（in vitro fertilization，IVF）过程中胚胎质量的良好预测因子，阳性和阴性预测值分别为84.4%和82.1%[16]，支持将mtDNA量化后作为衡量胚胎质量、预测胚胎植入潜力的生物标志物。

3 MtDNA突变与胚胎质量

鉴于mtDNA自身结构特点和独特的生物学环境，其突变比核基因组DNA（nDNA）更频繁[17]。环境和代谢因素、病原体等应激源会损害线粒体相关基因的表达，特别是一些与mtDNA复制、转录和编码OXPHOS复合体以产生ATP有关的基因。卵母细胞线粒体是各种应激源的关键靶点，当受到高强度的活性氧攻击时，大量的氧化应激可导致卵母细胞内线粒体形态和功能改变，引起生物体直接能量来源ATP合成障碍，当ATP水平降低到所需阈值以下会影响卵母细胞的减数分裂过程，造成胚胎发育异常，引发不良妊娠结局[18]。

MtDNA突变包括单个碱基替换、插入或大片段缺失。目前已鉴定出700余种mtDNA突变，其中一些与不孕症有关[6]。由于线粒体只遗传自母亲，卵子质量对不孕症治疗干预和生殖结局至关重要。有研究发现，mtDNA的缺失在退化或发育阻滞的卵母细胞中更为普遍[5]。高龄女性的卵子mtDNA 4 977 bp片段缺失率及mtDNA突变率明显高于年轻女性，认为高龄妇女卵子发育潜能降低与含有更多的缺失mtDNA有关。MtDNA 4 977 bp缺失可以作为卵子老化的标志物[19]。而高龄妇女mtDNA突变率高可能与氧化应激损伤有关，ATP合成减少，影响卵母细胞减数分裂，形成非整倍体胚胎，从而导致患者反复种植失败和复发性流产。弃卵母细胞和弃胚胎中4 977 bp缺失率较高，且与卵母细胞相比，胚胎中的缺失率明显较低，提示卵母细胞mtDNA 4 977 bp缺失与受精失败相关[20]。MtDNA与卵巢、卵子功能密切相关，线粒体相关基因突变可能导致原发性卵巢功能不全[21]。有研究发现，线粒体D-loop区域的变异会导致mtDNA复制和转录的异常，可影响线粒体呼吸链的功能，导致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平升高和不稳定，阻碍mtDNA的复制，减少mtDNA含量和线粒体数量，还可影响编码OXPHOS相关蛋白mtDNA基因的表达，影响线粒体代谢和氧化呼吸功能，导致细胞内ATP含量降低，影响卵子、胚胎质量及妊娠结局，认为不孕妇女外周血线粒体D-loop区突变的增加对IVF临床结局有预测价值[22]。由此可知，mtDNA突变对卵母细胞成熟和早期胚胎发育具有重要影响。

颗粒细胞中mtDNA是否存在4 977 bp缺失报道不一。有学者发现人颗粒细胞存在mtDNA 4 977 bp片段缺失，并可导致卵母细胞、胚胎发育异常及流失等，且与妊娠率呈负相关，与年龄呈正相关[23-24]。38岁以下妇女颗粒细胞mtDNA 4 977 bp片段的缺失率为5/12，而38岁以上妇女缺失率高达100%[25]。但也有研究显示，不论是否高龄，其卵丘颗粒细胞[26]、壁颗粒细胞[27]均不存在mtDNA 4 977 bp的缺失，这有待于进一步的研究。

4 问题与展望

综上所述，线粒体是影响卵母细胞质量及妊娠结局的重要因素。目前改善卵母细胞质量的方法主要是通过线粒体替代疗法增加线粒体数量和使用线粒体营养剂改善线粒体质量。改善卵母细胞线粒体质量的药物主要包括：生长激素、辅酶Q10、硫酸脱氢表雄酮等。线粒体替代治疗包括线粒体移植、卵胞质移植和原核移植等。线粒体异体移植由于引发的伦理问题已被禁用。自体移植以自体细胞为材料，可避免伦理问题，为改善卵母细胞质量提高妊娠率提供了新思考和新方向，逐渐成为近年研究的热点。目前通过移植来源于颗粒细胞、骨髓干细胞等体细胞的线粒体来改善卵母细胞质量及胚胎发育潜能已取得一定疗效，但其效果及远期安全性尚待进一步研究证实。来源于体细胞的线粒体具有组织特异性，在不同细胞中的作用并不相同，对促进胚胎发育的影响有限。线粒体最可靠的替代来源可能是生殖系细胞，尤其未经历有丝分裂后停滞的生殖系干细胞。有学者发现，移植来自生殖干细胞的线粒体后，卵母细胞质量差的受精率有显著提高[28]，也有研究显示此技术似乎不能改善卵巢早衰及IVF周期胚胎质量差的不孕患者的胚胎质量及临床结局，但该研究样本量较小，尽管妊娠率相似，但不能得出活产率相关的结论[29]。这些研究为改善卵母细胞质量和胚胎发育潜能开辟了新的思路。所以对卵子及其相关细胞线粒体结构和功能的研究将有助于生殖医学的发展和进步，为临床解决实际问题提供理论基础和临床依据。