全基因组测序在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌流行病学调查中的应用*

储丹丹 综述，单 斌△ 审校

(1.昆明医科大学第一附属医院医学检验科，云南昆明 650032；2.云南省检验医学重点实验室，云南昆明 650032)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种高致病性革兰阳性菌，常定植在健康人体鼻腔、咽喉、皮肤等部位[1]，当机体免疫力低下时可引起呼吸道、皮肤软组织、血液及医疗器械相关性感染，是引起医院和社区感染的重要病原菌之一[2]。MRSA具有多重耐药性，并且常携带多种毒力因子，由它所致的感染多呈流行或暴发，治疗困难大，病死率高，增加了社会经济和医疗负担[2]。因此，快速、可靠地鉴别及追溯医院和社区MRSA感染的源头，获得其分子特性，掌握疾病流行扩散的趋势，对于指导临床治疗和疾病防控至关重要[2-3]。本文就MRSA常规分型方法、细菌全基因组测序(WGS)概述、WGS用于MRSA流行病调查实例等方面进行简要综述。

1 MRSA的常规分子分型方法

目前对MRSA流行病学的研究主要采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、spa分型、SCC mec分型等技术[4-6]。PFGE利用限制性内切酶对细菌染色体DNA片段进行酶切，再将酶切片段电泳分离，最后对所得酶切图谱进行比对，分析各菌株间的相关性。MLST通过对MRSA染色体上的管家基因进行PCR扩增，并将测序结果与MLST数据库进行比对，从而根据碱基序列的差异及等位基因的不同组合类型分析菌株间的同源性和进化关系[7]。spa分型通过扩增编码葡萄球菌A蛋白(SPA)基因片段的X区来对MRSA进行分型。SCC mec分型则是利用多重PCR扩增SCC mec元件中的特有序列，与质控菌株比较得到分型结果[8]。但是，这些传统分子分型方法都是从细菌DNA片段或特殊位点入手，结果仅能反映细菌基因组的局部遗传信息，在高度克隆化的菌株或进行长时间跨度的流行病学研究时分辨能力有限[9]。此外，这些传统方法在实际操作时不仅费时，且不能在分型的同时获得耐药基因、毒力基因等反映致病性的重要信息，故在实际应用中稍显不足。

2 WGS概述

下一代测序(NGS)是一种允许数千到数十亿个DNA片段独立或同时进行高通量、大规模并行测序的方法[10]，近年来NGS的应用已经从研究工具过渡到诊断方法，并在临床微生物学实验室中的应用越来越普遍。WGS是最重要的一种NGS技术，已逐渐成为研究细菌流行病学特征的重要手段[11]。

相较于Sanger测序，WGS不需要针对不同DNA片段或细菌种属设计特定引物，而是通过大规模随机序列扩增和实时检测合成信号以获得大量原始数据，再通过各种生物信息学工具来分析序列数据的质量，并将未精确排序的原始测序数据转换为完整的基因组序列信息。尤其是细菌完成图的绘制可以非常清晰地了解基因组的结构，为研究细菌的功能和进化提供数据参考[12-13]。此外，WGS不仅可获得纯菌落的基因组信息，还可获得混合标本的基因组信息，故可以区分高度相关的谱系，具有其他方法没有的分辨率和精度。通过WGS技术，不仅可获得近乎完整的细菌 DNA信息，包括种属、耐药基因和毒力因子的携带情况、可移动元件等信息，还可对多个细菌间的基因组信息进行比较，对于耐药菌株的分子流行病学和传播机制研究至关重要[13]。

WGS在细菌流行病学调查中的应用与生物信息学技术的发展密不可分[3]。多种生物信息学工具的开发和成熟使微生物基因组序列分析工作日趋简便。目前，运用WGS数据进行菌株分型和溯源主要通过筛选细菌核心基因组的单核苷酸多态性(SNP)位点差异，以SNP差异数量的多少反映菌株基因组之间的差异，进而分析其同源性[12,14-15]。通常暴发流行菌株基因组之间的差异主要体现在单个碱基的变异，同源性比较接近，而散发菌株基因组之间差异较大，可能存在大片段序列的插入或缺失，所以SNP可以准确衡量菌株之间的差异。因此，在比较基因组SNP差异前，需要先确定菌株的核心基因组。简而言之，利用WGS溯源分析主要步骤包括：(1)获取WGS原始序列数据；(2)挑选合适的参考基因组序列；(3)确定所有基因组序列的核心基因组；(4)用SNP差异构建系统发生树，找到菌株之间的同源关系等。WGS应用于感染暴发菌株分析时，可以利用其基因组数据的强大分辨率和大量菌株信息，在进行充分分型的基础上对暴发菌株同源性的远近进行精确判断，并分辨出不同的进化路线，甚至可推算出基因组碱基突变需花费的时间[6,11]。

3 WGS在MRSA流行病学调查中的实践应用

近年来，WGS技术的广泛应用使人们能够对MRSA的传播模式进行更详细的研究，包括分析过去无记录的传播和全面、详细的菌株进化过程[16-18]。随着该技术的日益普及和成本的降低，WGS将不再局限于科学研究，而将越来越多地应用于常规临床实验室，为日常医疗和科研工作带来便利。目前，WGS已经在医院、其他医疗机构和社区的流行病调查中发挥重要作用，为医院和社区的疾病预防和溯源工作做出前所未有的贡献。

3.1医院内MRSA流行病学调查 新生儿和儿童免疫系统发育不成熟，一旦感染MRSA会造成严重的后果。因此，在新生儿科或儿科，WGS已被用于跟踪MRSA的传播和评价早期感染控制措施的效果。KOSER等[19]利用WGS证实MRSA在英国某院婴儿特护病房内部、产后病房和社区中传播，并证实一名医务人员携带的MRSA在病房内的播散使暴发感染发展为持续感染，同时证明了抗菌药物耐药基因和耐药表型检测结果之间的一致性。EARLS等[20]利用WGS证实发生在爱尔兰某院新生儿重症监护病房的两次MRSA暴发均由同一个型别且高度克隆的菌株引起，通过与国际菌株的比较，推断此次暴发菌株很可能来源于澳大利亚，因为该型别是澳大利亚的流行克隆菌株类别之一。DURAND等[18]通过WGS发现法国两次不同的新生儿MRSA暴发之间存在的传播证据，也同时排除了某些型别造成大规模地方性聚集感染的可能性，由此说明WGS具有足够分辨力来证实或排除由传统流行病学调查方法确定的暴发事件。

除新生儿科外，WGS在医院其他科室的菌株流行病学调查中同样重要。KONG等[21]采用WGS和传统分子分型方法对江苏某医院神经外科发生的一起疑似MRSA疫情进行研究，鉴定了此次疫情中的暴发菌株和散发菌株，此外WGS结果还证实耐药基因的存在与否与耐药表型检测结果基本一致，这是传统分子分型方法无法做到的。CUNNINGHAM等[22]用WGS联合PFGE对某院烧伤科分离的MRSA进行分析，发现虽然PFGE为同一型别，但WGS可将菌株分为高度克隆株和非克隆株，可见WGS具有远超于常规方法的分辨率。TONG等[23]用WGS证实了泰国某院病房内和病房间的感染传播事件，并证明每个病房中均有1例患者充当了暴发中传播源头的角色。RUBIN等[24]运用WGS证实长期携带MRSA的医务人员和感染预防控制工作中的偶然疏漏导致了MRSA间歇性小范围的医院传播。

3.2社区及其他医疗机构间MRSA流行病学调查 虽然医院感染预防和控制部门的重点范围是医院内部，但感染有时可能发生在医院外，比如来自其他医院、其他国家的患者，特别是曾在国外住院的患者。美国一项研究利用WGS对来自美国22个州及地区和其他7个国家的357株MRSA进行调查，详细分析了菌株在宾夕法尼亚州的起源及其随后的传播范围[25]。FLUIT等[26]将美国1株ST80 MRSA与欧洲分离的其他3株ST80型进行比对，发现所有菌株来源于约20年前的同一菌株，可见WGS对长时间大范围的院外传播具有很好的分析能力。HARRIS等[27]证明WGS可以用来研究MRSA的洲际和局部传播，揭示优势菌株的流行和微观进化，还证实该技术在追踪MRSA院内传播方面的潜力。

随着人口老龄化，老年患者从医院到其他医疗机构(如养老院)，从一家医院到另一家医院，从入院到出院的速度比以前更快，许多研究都重点关注到MRSA在这些过程中的传播[28-31]。一项研究用WGS对英国和爱尔兰的MRSA进行比较，结果表明在同一转诊区域内的医院检出的菌株有相似性，且在一家医院内的菌株传播是由从另一家医院转诊的患者引起的[32]。此外，在伦敦两家国家卫生服务医院和一家地区综合医院中进行的一项研究发现，医院频繁收治患者会导致医院内以病房为单位的传播[33]。

此外，WGS在MRSA定植与感染的研究中发挥着同样重要的作用[34]。在对荷兰一家肿瘤医院进行的一项医务人员无症状鼻腔细菌定植的研究中，WGS证实了MSSA和MRSA菌株在暴发中的相似性[35]。MOORE等[36]证明在MRSA的定植和感染研究中，WGS对其他方法无法区分的菌株具有很高的分辨率。

4 WGS在MRSA流行病学中的应用展望

WGS技术为医院、社区和其他医疗机构中MRSA的流行病学调查提供了新的分析手段，可以单独或联合传统方法对疑似暴发菌株进行分析，获得菌株的遗传信息、亲缘关系、传播路径、耐药性和毒力等特征，极大地扩展了对MRSA临床和流行病学方面的认识，包括医院和社区中传播克隆的共性及耐药决定因素的演变。随着该技术的发展，其价格越来越低，快速、精确、全面的优点将使得该技术越来越多地被应用到流行病调查中，通过对不同菌株所有遗传信息的比对，发现菌株之间的遗传特性差异及同源性，从而帮助院感科和疾控部门制订更准确、更详细的疫情防控方案，进而提高对MRSA暴发和流行的了解和控制。