与早产临产相关的转录组学研究进展

常颖，李雯，李姗姗，申永梅，陈叙

早产（preterm birth）是一个全球性的健康问题，由多种临床亚型组成，包括自发性或医源性早产。不论早产亚型如何，一旦早产临产，目前并无切实有效的方法延长孕周。为了制定有效的预防和治疗策略，应更深入地了解控制人类分娩时机的基因和途径。研究证明，早产病理生理机制不仅复杂，而且母胎组织间需相互作用才能促进分娩发生[1]。这些组织包括蜕膜、子宫肌层、宫颈、母体血液、胎膜（绒毛和羊膜）、脐带和胎儿血液等。与早产相关的主要病因学因素包括炎症、出血、母体或胎儿下丘脑-垂体轴激活、免疫失调、子宫肌层扩张和宫颈机能不全[2]。所有这些病因都有不同的、独特的分娩启动方式，但可能有一条共同的途径，即以促成子宫肌层收缩、细胞外基质成分降解、炎症、细胞凋亡的介质释放为终点，从而促进胎膜破裂、宫颈成熟和子宫收缩，导致早产发生。对这些组织的转录组研究有助于了解早产分子机制的发展。针对宫颈、子宫肌层和绒毛膜羊膜的转录组学研究显示，分娩是一种生理性炎症状态[3]。然而，找到与早产有关的特定通路现仍是一个遥不可及的目标。单细胞RNA测序技术（single cell RNA sequencing，ScRNA-seq）可用于推断母胎界面上不同细胞类型之间的通讯网络[4]。根据ScRNA-seq技术检测，母体巨噬细胞和绒毛外滋养层细胞是分娩过程中转录变化最大的细胞类型[5]。与相同胎龄非临产状态相比，早产临产后自然杀伤（NK）细胞、活化的T细胞和成纤维细胞信号增加，表明这些免疫细胞类型在早产病理生理中具有重要作用[6]。

1 早产母胎界面上不同组织细胞的转录组研究

目前研究表明，自发性早产可能涉及的一种机制是孕妇先天性免疫系统和适应性免疫系统之间相互作用的失调。妊娠期间，调节性T细胞会增殖，并通过产生抗炎环境来防止胎儿免疫排斥。临产开始和进展期，产妇的免疫系统通过激活促炎性核因子κB信号传导途径而转变为促炎状态，这导致细胞因子、趋化因子和白细胞介素（inlerleukin，IL）的产生增加，并通过激活白细胞而浸润到母胎界面。有学者认为，妊娠期间过早的从抗炎状态转变为促炎状态，会破坏先天性和适应性免疫平衡关系，导致早产临产[7]。妊娠组织尤其胎盘是多种细胞类型的异质复合物，因而若要阐明母胎界面的相互作用，需了解细胞水平的转录活性。研究人员用ScRNA-seq技术捕获人类胎盘细胞亚群的表达模式[4]，包括一些胎儿细胞（如绒毛外滋养层细胞和合体滋养层）、母体蜕膜细胞和混合来源细胞（例如T细胞）。在所有细胞类型特征中，B细胞和T细胞特征性表达随胎龄变化最为明显。B细胞特异性信号随妊娠进展呈线性下降，而T细胞特异性信号从妊娠早期到妊娠中期下降，然后在妊娠晚期增加。定量分析显示，足月分娩时T细胞特异性基因表达增加，如颗粒酶H（granzyme H，GZMH）、颗粒溶素（granulysin，GNLY）、成纤维细胞生长因子结合蛋白2（fibroblast growth factor binding protein 2，FGFBP2）和颗粒酶 A（granzyme A，GZMA）基因。有较多的证据支持妊娠妇女T细胞在足月和早产的病理生理过程中的作用，包括以母体T细胞浸润到胎盘组织为特征的组织病理学病变[8]，母胎界面的细胞和调节性T细胞亚群与足月分娩的时机和早产的发生有关[9]。胎儿T细胞还可以通过对母体抗原作出反应并释放促内分泌性细胞因子来参与自发早产的机制[10]。总的来说，这些研究表明T细胞与分娩的生理和病理过程有关，因而认为T细胞信号可作为分娩开始的标志[11]。

胎龄决定了早产的多种病理机制。遗传背景可能在小于28周前的早产新生儿中起更重要的作用。这些早产可能具有独特的转录组模式，涉及几种通路和基因在病理状态下被打开或关闭。根据目前的研究显示，导致分娩的共同途径主要与母胎界面（主要指绒毛膜、羊膜和蜕膜）发生的免疫过程调节有关。母胎界面趋化因子的下调可以防止免疫细胞大量涌入从而维持妊娠[12]，而消除这种下调状态可导致临产分娩。就早产而言，多种途径激活免疫系统消除了这种下调，表明早产基因表达模式与免疫排斥有关。Pereyra等[13]使用RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）分析了早产（小于33周）和足月产胎儿的绒毛膜转录组，发现与足月产相比，早产病例中有18个基因下调。这些基因潜在地代表早产转录组模式，因此是了解早产综合征的候选基因。这18个下调基因中，包括胎盘基因胎盘碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALPP）和妊娠相关血浆蛋白（pregnancyassociated plasma protein A，PAPPA 或 Pappalysin）。与另一项研究结果类似[14]。另外两个多能性调节干细胞信号途径的基因——Wnt家族成员1（WNT1）和远端无同源异型盒5（distal-less homeobox 5，DLX5）基因属于同一京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途径。WNT信号[15]或核因子κB信号[16]通路受抑制可能导致滋养层细胞增殖及侵袭减少，从而导致流产和PTB。DLX5调节胚胎和胎盘发育[17]，在人类胎盘中广泛表达。早产胎膜组织的WNT1和DLX5表达低于足月产胎膜。因此推测这些下调的基因可能是决定妊娠终止时机的成熟基因。

上调基因主要与免疫反应有关。与足月分娩相比，早产可以显著富集免疫过程。最近研究表明，IL-1β可能通过激活炎性小体而参与了临产[18]。极早产时IL-1β上调。如果炎症小体激活导致早产的假说是正确的，则可能具有医学意义，即炎症小体成分可以作为药物靶标，在完全免疫反应开始之前使用可能会终止PTB。其他与早产相关的差异基因还包括CXC型趋化因子配体（CXC motifchemokine ligand，CXCL）。CXCL10与母体抗胎儿排斥反应有关。在这种情况下，早产中CXCL10的过度表达可能会触发胎儿的炎症反应，从而导致早产[8]。CXCR3受体是跨膜G蛋白偶联受体，属于CXC趋化因子家族。在活化的T细胞、树突状细胞和NK细胞上表达。CXCR3及其配体CXCL10途径调节母体免疫细胞向母胎界面浸润，参与妊娠期间的母胎免疫耐受。该途径受到破坏则可能导致早产发生[8]。

然而，人体早产转录组研究的一个主要问题是无法收集相同胎龄的健康对照组织。之前的研究均使用健康足月组织作为病理性早产组织的对照，但这样观察到的差异基因实际上还包括与胎龄相关的基因，因此导致下游数据分析复杂化。一种潜在的解决方案是使用与人类密切相关的物种做对照。Eidem等[19]用此种方法比较了自发性早产的人类胎盘组织及与之相匹配胎龄的猕猴胎盘组织，确定了29个自发性早产特异性候选基因以及37个胎龄特异性基因。研究人员对这些候选基因的相对表达与人类蛋白质数据库（Protein Altas）进行比较，以评估转录谱表达。尽管这些候选基因与公开发表在Protein Altas数据库中的表达水平相当，但仍有一些差异。如人HtrA丝氨酸肽酶4（Human HtrA Serine Peptidase，HTRA4）自发性早产转录组中高表达，而在足月分娩时低表达。但由于猕猴与人之间在妊娠时长和发育时间有所不同，跨物种的转录组的比较仍需更详细的分类以及消除“遗传背景的影响”。

2 子宫肌层转录组研究与早产临产

在人类妊娠的整个过程中，子宫肌层必须适应胎儿胎盘生长所需的肌壁扩张，同时保持功能性静止。分娩时则需要剧烈而协调的子宫收缩，最终胎儿娩出。这个过程的转变需要对影响子宫肌层结构、收缩性和信号传导的编码基因进行高度复杂的调控[20]。

在过去的20年中，多项研究发表了临产和非临产状态下子宫肌层之间的转录差异。从早期的微阵列研究到后来的RNA-seq，研究数据显示临产与炎症信号有关，包括与细胞因子、趋化因子和免疫反应有关的基因/通路。尽管这些研究提供了可比较的子宫肌层转录组数据，但仍未能鉴定出可重复、可靠的有关人类分娩的转录标志和信号网络，且缺乏对数据之间变异性和一致性的比较。基于这些原因，Stanfield等[3]利用了3个转录组数据库并使用2种机器学习算法来预测分娩，发现在子宫肌层中存在强大的分娩转录标志。在信号通路水平上也观察到了这种标志，其中与临产有关的通路包括经由核因子κB、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1(mammalian target of rampamycin complex 1，MTORC1） 和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）信号等。分娩过程中宫颈、胎膜和子宫肌层的TNF-α表达增加，刺激花生四烯酸释放，激活磷脂代谢及子宫肌层中产生前列腺素。Ackerman等[20]通过整合微小RNA（miRNA）和mRNA转录网络信息，发现肌细胞增强因子 2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）家族的 2 个同工型MEF2A和MEF2C可能在整个妊娠过程中都有助于维持子宫肌层处于静止状态。此外，有证据表明MEF2C可以抑制炎症并降低内皮细胞中核因子κB的活性[21]。鉴于核因子κB是子宫肌层临产相关的主要炎性调节因子，MEF2转录因子也可能通过对抗促炎信号而促进子宫静止。以上子宫肌层转录组研究表明，自发性早产具有足月临产时的许多共同特征，可能从孕中期开始共享同一机制[20]。虽然自发性早产和足月临产的启动基因不同，但最终合并为人类临产子宫肌层的共同效应途径。

双胎比单胎早产风险更高。在对比单胎早产和双胎早产的子宫肌层转录组时发现，尽管诱发双胎早产的因素与单胎可能不同，感染或宫颈短可能在双胎孕妇中更常见，其他因素如子宫（过度）扩张、过早激活收缩通路、内分泌差异等也可能更为显著，但针对单胎妊娠和双胎妊娠子宫肌层转录组分析研究表明，与分娩启动相关的关键炎症介质，如环氧合酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2）、催产素受体（oxytocin receptor，OTR）、促炎因子IL-8以及从子宫内膜中释放的细胞因子等，在双胎与单胎间几乎没有差异，至少在控制妊娠时长方面没有差异[22]。但此项研究存在局限性，如这些子宫肌层组织均在未临产时选择性剖宫产过程中获得，与真正临产时的转录变化可能有差别。另外，早产往往存在影响母婴健康的因素，可能导致转录组学的结果不同。对啮齿类动物子宫肌层组织分析中也发现，早产发生时炎症性基因上调，包括 TNF-α、IL-1B、IL-6、15-羟前列腺素脱氢酶和COX-2等，IL-1B和TNF-α诱导COX-2合成前列腺素，导致肌肉收缩[23]。

综上所述，早产临产时转录组学变化也体现出促炎因子的过早激活。但由于缺乏足够有效的与胎龄相匹配的早产子宫肌层组织，因而早产临产时子宫肌层转录组学变化是否与足月时相同，还需进一步研究。

3 与早产有关的母体外周血转录组研究

在过去的10年中，寻找非侵入性方法替代标准组织活检引起了学者们的极大关注。细胞游离DNA（cell free DNA，cfDNA）技术的进展为临床应用铺平了道路。然而，cfDNA分析在很大程度上依赖于突变、多态性或结构变异，在与遗传差异无关的疾病和生理场景中影响了其使用。相比之下，细胞游离RNA（cell free RNA，cfRNA）转录组可直接获取遗传信息，并反映所来源组织的生理学信息。cfRNA反映与细胞活动相关的随时间的动态功能变化[24]。与其他非侵入性生物标志物相比，cfRNA表达谱可以提供更丰富的分子内容。已有研究显示cfRNA可以反映胎儿生长发育、预测早产等[25]。

由于与早产有关的胎盘RNA和与妊娠有关的miRNA转录本通常会释放到血液循环中，因而有研究检测到早产患者外周血中最稳定的458个外显子（395个基因）。这395个基因中，有12个通路过度表达[26]，包括B细胞活化、T细胞活化、趋化因子和细胞因子介导的炎症通路、胎儿生长因子（fetal growth factor，FGF）和内皮生长因子（epidemal growth factor，EGF）受体信号传导通路以及整合素通路。FGF家族成员在胚胎发育的最早阶段和器官发生期间起作用，以维持祖细胞生长、分化、存活。EGF受体信号传导途径是调节哺乳动物细胞生长、存活、增殖和分化的最重要途径之一。整合素蛋白在细胞骨架结构和细胞外基质之间提供联系，并参与各种信号传导过程以促进细胞生长。因此，以上通路过度表达表明妊娠和早产分别与免疫调节及炎症有关。Gomez-Lopez等[27]对49例孕妇自妊娠8周开始采集外周血，整个孕期约采集4～6次血样，对细胞转录组动力学及其与血浆蛋白组的相关性进行了系统生物学分析，发现在正常妊娠过程中，14号染色体是转录本差异表达最丰富的；与宿主免疫应答相关的基因，如基质金属蛋白酶8（matrix metalloproteinase 8，MMP8）、防御素 A1B（defensin Alpha 1B，DEFA1B）、DEFA4、乳铁蛋白（lactotransferrin，LTF），在妊娠 10～40周时表达稳定增加；妊娠期T细胞、B细胞、红细胞的mRNA信号表达呈独特的模式，表明正常妊娠是免疫生物学过程。另一项研究招募了31例妊娠妇女每周检测外周血直至分娩，共521个样本，通过建立随机forest模型鉴定出7个胎盘特定cfRNA与早产有关，分别是 CLCN3、DAPP1、PPBP、MAP3K7CL、MOB1B、RAB27B和RGS18。与宫颈长度测量和胎儿纤维连接蛋白的预测价值相比，cfRNA预测早产的阳性预测值可达到80%[14]。因而研究者认为，与胎盘基因相关的外周血cfRNA可能对胎儿生长发育和胎龄提供较好的评估手段。

4 结语与展望

早产是全球新生儿死亡的主要原因。迄今为止，仍没有找到有效的预测方法。使用RNA-seq分析方法可以鉴定既往报道的基因和通路以及筛选新的候选基因。母胎转录组数据的荟萃分析表明，自发性早产可能涉及到妊娠妇女先天性免疫系统和适应性免疫系统之间相互作用的失调[7]。但目前所分析的数据还存在局限性。未来依靠系统生物学分析，可开发和完善妊娠基因表达谱模型，以识别早产和足月分娩的分子过程。对母体外周血进行组学研究，以期实现早产等母胎并发症的早期预测。总之，随着系统生物学的发展，可以优化选择更接近疾病过程的生物样本进行早产机制研究及预测。