利用吖啶橙染色快速鉴定重力密度梯度沉降法中生精细胞类型的方法研究

林法喜，孙红勇*

（南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210029）

精子发生是一个细胞分化过程，高度有序，男性不育受到精子发生异常的直接而深刻的影响[1]。现阶段，对生精细胞分化进行稳定研究的细胞平台仍然缺乏，在研究精子发生的过程中需要将特定类型的生精细胞从研究物种的睾丸中分离出来作为研究起始材料[2]。重力密度梯度沉降法能够将生精细胞分离出来，和二代测序技术有机结合将生精细胞特异的miRNA表达谱在鼠精子发生过程中的变化规律、4种生精细胞中miRNA表达谱变化规律寻找了出来[3]。本文研究了重力密度梯度沉降法中生精细胞类型吖啶橙染色快速鉴定的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

购买北京大学医学部实验动物学部提供的20只3周龄、10只5周龄SPF级ICR品系雄性小鼠，动物许可证号：SCXK（京）2016-0010。

1.2 实验试剂

购买Sigma公司生产的花生凝集素（FITC标记）、胰蛋白酶、胶原酶、DNAasel，Hyclone公司生产的1640培养基，罗氏公司生产的细胞核染料，BD Falcon公司生产的40μm细胞网筛。

1.3 方法

1.3.1 分离生精细胞

运用重力密度梯度沉降法，粗线期从3周小鼠睾丸获得精母细胞、长形、圆形精子细胞。运用颈椎脱臼法将小鼠处死，将睾丸取出来，将白膜剥去。用小剪刀剪碎曲细精管至浆糊状，向50ml离心管中转移，用Krebs溶液补到20～25ml，冰上进行5min静置，将上清弃去。将10μl 1g/L DNase I+10ml 1g/L胶原酶加入，在37℃温度下进行10min水浴振荡，同时不时吹吸，在此过程中将吸管充分利用起来，消化生精小管为极小片段，镜检从生精上皮分离出大多数生精细胞，之后将30ml左右预冷的Krebs溶液加入，将消化终止。在4℃的温度下进行5min离心，将速率设定为1000r/min，将上清弃去，将10μl 1g/L DNase I+5ml 1g/L胰蛋白酶加入，在37℃的温度下进行10min左右的水浴振荡，同时不时用吸管吹吸，直到镜检视野中绝大多数为散在的单细胞，将30ml左右预冷的0.5% BSA/Krebs溶液加入，将消化终止。在4℃温度下进行5min离心，将速率设定为1000r/min，将上清弃去。用0.5% BAS/Krebs洗细胞沉淀1次，在4℃温度下进行5min离心，将速率设定为1000r/min，将上清弃去。最后悬起细胞沉淀，在此过程中将15～20ml 0.5%BSA/Krebs充分利用起来，同时经40μm细胞网筛过滤。将细胞收集起来并编号，每管12ml左右，将150μl从每管中取出来，在96孔板中加入，将1.5μl 0.2g/L吖啶橙染液加入到每孔中，以轻柔的动作拍打混匀。将细胞纯度、类型确定下来，途径为荧光倒置显微镜（Zeiss Axio Observer DI）下观察，并将同类细胞合并。吖啶橙染色观察：荧光通道镜下细胞核、细胞质分别深染、浅染，分别呈绿色、淡黄色或橘黄色，具有较为清晰的染色背景、显著的形态。但是拍摄出的图片在相机的限制下只能区别细胞核、细胞质的深染、浅染。

1.3.2 荧光染色

用PBS液洗涤生精细胞2次，每次在4℃温度下进行5min离心，将速率设定为2000r/min，之后向1.5ml离心管中转移，用1ml PBS悬起，将20μl细胞悬液取出来涂片，自然晾干。室温下将细胞涂片固定起来，在此过程中将4%多聚甲醛充分利用起来，0.5% Triton X-100透化，同时漂洗，在此过程中将PBS充分利用起来，将FITC/PNA染顶体20μg/ml加入，室温下进行40min左右的孵育，将DAPI染细胞核1μg/ml加入，室温下进行5min的孵育，漂洗过程中将PBS充分利用起来，封片观察。

2 结 果

2.1 吖啶橙染色能够将合胞体对生精细胞鉴定的干扰排除

吖啶橙染色能够对光镜下合胞体现象（两个或多个细胞聚集形成）与圆形细胞进行有效区分。

2.2 吖啶橙染色鉴定小鼠粗线期精母细胞

光镜下粗线期精母细胞具有较大的直径，为12～18μm，平均（15.2±2.3）μm，呈球形。吖啶橙染色结果表明，粗线期精母细胞较大，具有较多的核质比、显著的染色质结构。

2.3 吖啶橙染色鉴定小鼠圆形精子细胞

光镜下圆形精子细胞直径为8～10μm，平均（9.1±1.2）μm，呈球形。吖啶橙染色结果表明，圆形精子具有较小的体积，在细胞中央或偏向细胞一侧分布，细胞核为圆形。

2.4 吖啶橙染色鉴定小鼠长形精子细胞

光镜下长形精子形变，具有各异的形态。吖啶橙染色结果表明，长形精子细胞的细胞核形变，浓缩变小，通常呈显著长条形，具有极性。

2.5 3种生精细胞DAPI/PNA染色鉴定纯度

荧光染色分离到的粗线期精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞的细胞核/顶体纯度均为90%。

3 讨 论

在重力密度梯度沉降法中，如何将高纯度的生精细胞获取过来是一个技术难题，而对分离到的生精细胞纯度来说，镜检沉降后分离出的各管细胞组分发挥着极为重要的作用[4]。本研究改进了镜检方法，用吖啶橙荧光染色收集到的每管细胞，只需要在96孔板中加入吖啶橙染液就能够观察，不需要额外处理细胞，和细胞核细胞质形态检测中细胞大小形态检测中直接光镜下观察相比具有较短的检测时间、较为简便的操作，能够将长形、圆形精子细胞、粗线期精母细胞精确、快速镜检出来，从而促进生精细胞得量、纯度的有效提升。本研究结果表明，吖啶橙染色能够对光镜下合胞体现象（两个或多个细胞聚集形成）与圆形细胞进行有效区分。光镜下粗线期精母细胞呈球形，具有较大的直径。粗线期精母细胞较大，具有显著的染色质结构、较多的核质比。光镜下圆形精子细胞呈球形。圆形精子具有较小的体积，在细胞中央或偏向细胞一侧分布，细胞核为圆形。光镜下长形精子形变，具有各异的形态。长形精子细胞的细胞核形变，浓缩变小，通常呈显著长条形，具有极性。荧光染色分离到的长形精子细胞、圆形精子细胞、粗线期精母细胞的细胞核/顶体纯度均为90%，充分证实了这一点。

综上所述，重力密度梯度沉降法中生精细胞类型吖啶橙染色快速鉴定的效果好，值得推广应用。