中性粒细胞胞外诱捕网与肺疾病研究进展

徐苏晴 常明 卢红艳

中性粒细胞在机体对抗病原的先天免疫中起着关键作用。在感染早期，中性粒细胞在蛋白水解酶、抗菌蛋白和活性氧(Reactive oxygen specie, ROS)帮助下迁移到感染部位，吞噬并杀死细菌。Brinkmann[1]于2004年发现，中性粒细胞在细胞外产生一种由组蛋白、DNA和蛋白酶(Elastinase, NE)组成的网状结构，即中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps, NETs)。中性粒细胞形成NETs的过程被称为NETosis，这是一种有别于细胞坏死和凋亡的特殊细胞死亡程序。在NETosis过程中，核膜、细胞核和颗粒膜裂解并融合，细胞膜保持完整。尽管NETs在病原体防御中起重要作用，但其产生过量或降解不足也会导致宿主损伤。NETs在免疫系统、心血管系统及呼吸系统等疾病中已有较多研究。本文将综述中性粒细胞胞外诱捕网在细菌或病毒感染因素、自身免疫因素、全身性疾病及肺部肿瘤导致肺疾病中的作用。

NETs的概述

一、NETs的结构特征

NETs是以DNA为骨架，其间镶嵌多种蛋白成分的DNA-蛋白质复合物，蛋白成分主要是组蛋白，其次是粒状酶和多肽，包括中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)、瓜氨酸组蛋白3(Citrulline histone, Cith3)、组织蛋白酶G、白细胞蛋白酶3、乳铁蛋白、明胶酶、溶菌酶C、钙保护素、中性粒细胞防御素和组织杀菌素。在电镜下，NETs的基本骨架是直径约17 nm的染色质，周围包绕直径约50 nm的颗粒蛋白等颗粒状物质，NETs可为破碎或棉样结构，也可为线状、网状、膜状或点状结构。NETs中DNA网状结构和附着蛋白的完整性为其捕获病原体功能提供保障[2]。

二、NETs的生成

生物体或病原体产生的各种生物分子均可诱导中性粒细胞活化，中性粒细胞活化产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(Nox 2)，释放大量ROS，通过与Toll样受体4 (Toll-like receptors 4, TLR4)结合，导致中性粒细胞核膜分裂[3]。此外，细胞内NE和MPO通过中性粒细胞核膜分裂向细胞核迁移，部分降解特定的组蛋白，促进染色质解凝。肽赖氨酸脱氨酶4(Peptidylarginine deiminase 4, PAD4)诱导的组蛋白瓜氨酸化将进一步促进染色质解凝。染色质解凝后，疏松的染色质与颗粒状的细胞质和各种蛋白质混合，然后全部进入细胞外空间，形成网状结构[4]。

三、NETs的免疫逃逸

免疫逃逸是病原体通过其结构与非结构物质，拮抗、阻断和抑制机体免疫应答从而加重病原体对人体危害的方式。NETs对多种病原体均有不同程度的抗感染作用，而这些病原体也通过不同方式逃避NETs捕获。病原体可释放IL-10抑制剂阻断TLR诱导的ROS生成或利用核酸酶来攻击NETs的DNA骨架，从而阻断NETs的生成，进行免疫逃避[5]。病原体还可通过表面蛋白分子，负性调节中性粒细胞活性，从而抑制NETs的生成[6]。

NETs与肺疾病

多种因素均可导致肺部疾病，例如细菌或病毒感染因素、自身免疫因素、全身性疾病及肺部肿瘤等。这些因素导致的肺疾病与NETs有着密切关系。

一、NETs与肺炎链球菌感染

肺炎链球菌是导致社区获得性肺炎最常见的病原体。肺炎链球菌为革兰阳性细菌，其主要致病成分为荚膜、脂磷壁酸和链球菌溶素。中性粒细胞在接触肺炎球菌时可释放NETs，损伤肺组织[7]，Nel[8]等研究表明，肺炎链球菌介导的NETs形成依赖于链球菌溶素，该机制独立于Toll样受体4 (TLR4)或ROS。而相反的结论表明，肺炎链球菌刺激后NETs的释放与链球菌溶素无关，而与自噬有关[9]。因此，肺炎链球菌诱导NETs的直接机制尚不清楚。NETs可使肺炎链球菌固定，并限制其在宿主中传播。肺炎链球菌可利用脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)降解NETs，从而进行免疫逃逸。研究者利用质谱分析证实TatD是一种潜在的细胞外DNA酶，可降解NETs的网状结构。TatD的DNase活性有助于肺炎链球菌从NETs的网状结构中逃逸。在脓毒症小鼠模型中，与野生型肺炎链球菌感染相比，敲除TatD的链球菌感染后，小鼠表现为链球菌感染减少，肺组织损害减轻，存活率提高。TatD抑制剂或可避免肺炎链球菌发生NETs相关的病原逃逸，从而成为治疗肺炎球菌肺炎的潜在靶点[10]。在临床病例研究中，有研究者发现社区获得性肺炎可导致NETs水平升高，且血清中NETs升高的患者临床不稳定性增加、住院时间延长。由此预测NETs是一种新的预后指标，也是社区获得性肺炎辅助治疗的可能靶点[11]。

二、NETs 与呼吸道合胞病毒感染

呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿常见呼吸道感染病毒。中性粒细胞及其产物存在于RSV感染患儿的呼吸道，将增加其症状严重程度[12]。RSV是一种单链RNA病毒，其基因组可编码多达11种蛋白质。其中融合蛋白(F)存在于病毒粒子表面，在病毒进入时介导病毒包膜与靶细胞膜融合[13]。有证据表明，NETs能够捕获RSV，从而阻止病毒颗粒与靶细胞结合，防止感染。NETs的形成可能是限制RSV病毒扩散的重要机制[14]。但与此同时，F蛋白以ERK和P38mapk磷酸化依赖的方式诱导NETs生成，其网状结构被中性粒细胞弹性酶和髓过氧化物酶修饰，这些颗粒蛋白可以损伤组织，加重症状，损害肺功能[15]。以上结果表明，RSV 中F蛋白诱导NETs形成在RSV感染中起“双刃剑”作用。由黏液、中性粒细胞的细胞碎片和脱落的支气管上皮细胞组成的致密栓子造成小气道阻塞是RSV下呼吸道疾病(RSV lower respiratory tract disease, RSV-LRTD)患者的主要病理特征[15]。在患有严重RSV-LRTD婴幼儿的支气管肺泡灌洗液(BALF)中，研究者发现了NETs的网状结构[16]。Cortjens[17]等则进一步证实，在严重RSV-LRTD患者中，NETs的形成促进中性粒细胞耗竭，导致气道中粘蛋白含量增高，气道阻塞症状加重。对于严重RSV-LRTD气道阻塞患者，针对NETs的靶向药物是一种新的治疗措施。

三、NETs与哮喘

支气管哮喘(哮喘)(bronchial asthma)为呼吸系统中常见疾病，嗜酸性粒细胞、T细胞、肥大细胞、中性粒细胞和树突状细胞及多种细胞组分均参与哮喘病程。重症哮喘可诱导肺损伤发生。在哮喘过程中，中性粒细胞为调节细胞，可以在气道中浸润，释放细胞因子和炎症介质，调节其他细胞的功能，从而在哮喘中发挥重要作用[18]。在仙台病毒(SEV)诱导C57BL/6J小鼠哮喘模型中，研究者证实哮喘患者气道中性粒细胞可形成NETs[19]。在嗜中性哮喘患者(痰中中性粒细胞比例超过嗜酸性粒细胞比例)血浆中，IL-8、中性粒细胞计数和NETs均升高[20]。经鼻病毒(RV)感染后，过敏小鼠气道内大量中性粒细胞募集和过量NETs沉积与大量双链DNA(dsDNA)释放相关，可促进2型免疫反应，进而加重哮喘症状。经dsDNA处理的过敏小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数量和百分比均高于对照组，而小鼠在使用DNase处理后，血清IgE浓度、BALF中黏蛋白5AC(MUC5AC)和气道炎症细胞浸润的浓度均降低，且呼吸道粘液产生减少，气道高反应得到缓解[21]，提示dsDNA作为NETs的组成成分在哮喘过程中发挥重要作用，有研究者认为，NETs可介导炎症小体激活与单核细胞中IL-1分泌,引起气道上皮细胞损伤，加哮喘症状[22]。Pham[23]等则通过临床试验证实，NETs会造成气道上皮损害从而加重哮喘症状。以上研究说明，NETs在哮喘发生发展中扮演重要角色。在哮喘治疗过程中，糖皮质激素发挥重要作用。有研究者认为，糖皮质激素在体外和体内都能降低哮喘肺组织中NETs形成，并提出利用重组人DNA酶来消除NETs或将成为哮喘的一个新的潜在治疗靶点[24]。

四、NETs与脓毒症性肺损伤

脓毒症可造成多种器官损伤，如急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)，损伤严重的急性肺损伤(ALI)可进展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其临床特征为肺血管通透性增高，肺间质及肺泡水肿，从而导致顽固性低氧血症。研究表明，NETs的产生对于ALI的进展起重要作用。在疾病初期，NETs的形成可捕获病原体，但随着NETs的过度形成可造成肺组织损伤，加重疾病症状。研究发现，在小鼠脓毒症性肺损伤模型中，气管内接种聚肌胞苷酸(poly I:C)小鼠的BALF中，中性粒细胞浸润明显增加，同时炎性细胞因子IL-1β、IL- 6和TNF-α在肺部也显著升高，在其肺组织中MPO和Cith3表达明显升高，表明NETs形成增多。poly I:C诱导NETs和ALI的形成，与p38 MAPK的激活和claudin-5的表达降低有关[25]。研究者在脂多糖(LPS)致死性脓毒症小鼠模型中发现，LPS诱导的PAD的激活以及随后Cith 3介导NETs的形成增加了内皮细胞的通透性和肺功能障碍,而通过减少PAD的激活，可阻断LPS诱导的肺血管渗漏，减轻急性肺损伤，提高存活率[26]。通过经盲肠结扎穿刺(CLP)诱导脓毒症，发现细胞外冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)通过上调PAD4的表达诱导肺部NETs形成，从而加重脓毒症性肺损伤[27]。这些研究提示NETs在脓毒症性肺损伤中发挥重要作用。在脓毒性肺损伤小鼠模型中，肝素可与 NETs中带正电荷的组蛋白相结合，降低NETs的活性，减弱NETs介导的促凝效应，降低NETs对肺组织的损伤，这一观点或可为脓毒症性肺损伤提供治疗新思路[28]。

五、NETs与肺癌

肺癌(Lung cancer)是起源于支气管上皮的恶性肿瘤，其发病率居恶性肿瘤之首，肺癌的早期诊断率低，预后差，因此肺癌的早期诊断对改善肺癌的预后具有重要作用。研究证实，肺癌细胞培养上清液中的细胞外RNA(exRNAs)可间接诱导网，并参与肺癌的发生[29]。Albrengues[30]等人在肺癌休眠期小鼠模型中，利用烟草烟雾或经鼻腔注入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)引起的持续性肺炎症的同时，体内大量生成NETs。中性粒细胞弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶9是NETs相关的蛋白酶，它们都是序列裂解的层粘连蛋白。蛋白水解重组层粘连蛋白通过激活整合素a3b1信号通路诱导休眠癌细胞增殖。开发针对NETs重构层粘连蛋白的抗体可阻止休眠细胞觉醒，这种防止休眠细胞觉醒的疗法或可延长癌症患者的生存时间。在非炎性条件的肺癌模型中，研究者发现游离巯基是血浆维持氧化还原平衡的关键物质，而白蛋白是其主要储存库，游离巯基可用来清除循环中性粒细胞中的活性氧(ROS)，当这种白蛋白巯基库在癌症状态下耗尽时，白蛋白氧化导致游离巯基丢失，从而血浆氧化还原失衡，这一过程可使中性粒细胞内活性氧(ROS)的积累诱导NETs产生，由此形成的NETs主要存在于肺内，它们有助于循环肿瘤细胞的定植，从而导致肺转移[31]。抗NETs疗法和将NETs作为潜在的预测标志物或可提供一种有效的临床策略来对抗肺癌转移。

展望

自NETs发现以来，研究者在各类疾病中发现并研究NETs产生机制。现已证实，产生过多或降解不足的NETs会对机体产生损伤，进而加重疾病症状。NETs抑制剂则成为治疗疾病新的靶点，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中，重组DNase已成功应用于疾病痰液的液化，此外蛋白酶抑制剂也被应用于该疾病[32]。但NETs在各种肺疾病中产生的具体机制尚不明确，这也为今后的研究提供新的方向。