利格列汀对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响

宋利华 丁慧 刘杰 白杨 杜玉茗

(1吉林省人民医院老年医学科，吉林 长春 130021；青岛市第三人民医院 2内分泌科；3心内科；4吉林大学白求恩第一医院心脏外科)

糖尿病心肌病(DCM)的特征包括心肌纤维化、炎症、细胞凋亡和心室重构〔1〕。 糖尿病通过包括代谢紊乱在内等多种途径影响心脏〔2～4〕。心肌细胞凋亡的增加与DCM发展有关〔5,6〕。有研究表明〔7〕，利格列汀可降低主要心脏不良事件发生率，可能有独立于降糖作用之外的心血管保护作用，但其机制尚未完全阐明。本研究旨在观察利格列汀对糖尿病心肌细胞凋亡的影响，探讨其对糖尿病心肌细胞保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 4周龄清洁级雄性Wistar大鼠36只，体重(200±10)g〔购于辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证SCXK(辽)2015-0001〕，饲养于无特定病原体级(SPF)动物房。

1.2实验药物 利格列汀片(上海勃林格殷格翰药业有限公司,注册证号：H20130890)，链脲佐菌素(STZ,Solarbio公司，货号S8050)，羧甲基纤维素钠(Sigma公司，货号9004-67-5)。

1.3主要试剂 Wanleibio公司提供的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡试剂盒(WLA029),全蛋白提取试剂盒(WLA019)，Bcl-2(WL01556)，Bax(WL01637)，酶切caspase-3(WL01992)等。

1.4实验动物制备及分组 简单随机的方法分别选取正常对照组(A组，8只)和利格列汀对照组(B组，8只)，持续普通饲料喂养。其余大鼠采用高脂饲料喂养(20%蔗糖、10%猪油、2%胆固醇、1%胆酸钠、67%基础饲料)。4 w后，A、B组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液，剩余的20只大鼠禁食24 h，腹腔单次注射小剂量35 mg/kg STZ,并于3 d后尾静脉取血测血糖浓度，血糖浓度≥16.7 mmol/L确定为建模成功。

1.5给药方法 造模成功后，喂养至6 w，将存活的17只糖尿病大鼠采用随机数字表法分为糖尿病组(C组，8只)和糖尿病/利格列汀组(D组，9只)。大鼠均等体积1 %羧甲基维素钠溶液灌胃；另外，B和D组3 mg/(kg·d)利格列汀灌胃；持续4 w。

1.6血糖测量 造模时、治疗1和4 w末尾静脉采血测随机血糖，采用葡萄糖氧化酶法测定。

1.7TUNEL法染色 大鼠心肌组织石蜡包埋切片、脱蜡至水、组织透化、过氧化氢封闭、孵育、酶标记、过氧化物酶(POD)标记、二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木素复染、封片、镜检显微镜下观察染色效果，400×镜下拍照。细胞发生凋亡经TUNEL检测显色后呈现细胞核棕黄色-棕褐色，即凋亡细胞，用凋亡率来量化。

1.8Western印迹检测 心肌组织裂解匀浆后二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量：蛋白质抽提、蛋白质定量、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转印至聚偏二氟乙烯膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、电化学底物发光、图像保存。扫描胶片，用凝胶图像处理系统分析光密度值。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析和LSD检验、t检验。

2 结 果

2.1血糖比较 同一时期比较，C、D组血糖明显高于A、B组(P<0.05)；治疗1 w时，C组与D组血糖无变化(P>0.05)；治疗4 w时D组血糖明显低于C组(P<0.05)。与治疗1 w比较，治疗4 w A与B组无明显变化(P>0.05)；C组血糖显著升高(P<0.05)，D组血糖显著下降(P<0.05)，见表1。

表1 各组治疗1、4 w血糖水平的比较

与A、B组比较：1)P<0.05；与C组比较：2)P<0.05；表2同

2.2心肌组织TUNEL凋亡染色 与治疗1 w比较，治疗4 w A组凋亡无统计学差异(P>0.05)，B、C、D组凋亡显著增加(P<0.05)。与A、B组比较，C组和D组心肌细胞凋亡数量显著增多(P<0.05)；D组心肌细胞凋亡程度显著低于C组(P<0.05)。见图1及表2。

图1 各组治疗不同时间心肌组织TUNEL凋亡染色结果(×400)

表2 各组凋亡1、4 w心肌细胞凋亡率比较

2.3各组心肌组织中caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达 与治疗1 w比较，4 w 4组心肌细胞的caspase-3蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达显著下降；A和B组Bax蛋白表达下降，无统计学差异(P>0.05)，C与D组Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)；说明随时间的延长，凋亡蛋白表达增加，抗凋亡的蛋白表达下降。

4 w时，与A、B组比较，C组caspase-3、Bax蛋白表达明显上调(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.05)；与C组比较，D组caspase-3、Bax蛋白水平明显下降(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，说明利格列汀治疗后凋亡蛋白表达下降，抗凋亡蛋白表达增加。见图2，表3。

图2 各组治疗1、4 w心肌组织中caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达

表3 各组治疗1、4 w心肌细胞caspase-3、Bax、Bcl-2表达比较

与A、B组比较：1)P<0.05；与C组比较:2)P<0.05；与治疗1 w比较：3)P<0.05

3 讨 论

糖尿病发展和进展导致一系列并发症，影响人体大多数主要器官的功能〔8〕。DCM是Asbun等〔9〕首次提出的糖尿病心脏并发症之一。早期研究发现，心肌细胞凋亡和坏死发生在DCM中，并在DCM的发展中发挥了重要作用〔10,11〕。有研究表明，细胞凋亡是DCM重要的病理特征〔12〕，本研究中检测到糖尿病大鼠心肌细胞凋亡增加，这与国外报道相一致〔13〕。糖尿病并发症现在被认为是许多国家糖尿病人群死亡的主要原因之一〔14,15〕。因此，减少心肌细胞凋亡无疑是防治DCM，降低糖尿病患者死亡率的重要手段。高糖导致线粒体受损，引起心肌细胞凋亡〔16〕。细胞凋亡通常是由于线粒体渗透性改变，导致细胞色素C释放，caspase-3 被激活引起〔17〕。大量结果表明，Bcl-2 和Bax 在凋亡通路中有重要作用〔18〕，Bcl-2 和Bax 基因在凋亡过程中是功能对立的重要调控基因，caspase-3 是凋亡过程中重要的执行蛋白酶，Bcl-2、Bax 通过调控caspase-3 活性而发挥抗凋亡作用〔19〕。Bcl-2 作为抗凋亡因子，其同源二聚体可以维持线粒体的稳态，而且Bax 同源二聚体可以直接激活caspase-3〔16〕。活化的caspase-3可通过催化细胞基质裂解，加速细胞程序性凋亡〔20〕。

本研究表明，利格列汀可能通过对凋亡蛋白的调节而发挥心肌保护作用，但由于作用机制复杂，本研究只是从经典的凋亡蛋白途径进行分析，可能还存在其他信号通路或细胞因子参与心肌细胞的保护作用，有待进一步研究，但其仍为防治DCM发生、发展提供了新思路和治疗靶点。