IL-6信号通路及其调节GATA-6启动子甲基化在肺动脉高压形成中的研究进展

廖剑雄，张一驰，王炳今，张 谦，刘维佳

肺动脉高压(pulmonary hypertension， PH)是以肺动脉压力和肺小血管阻力进行性增加为特征的临床-病理生理综合征,主要表现为肺血管过度收缩、肺小动脉重构，最终导致心力衰竭。美国流行病学统计资料表明，PH患病率至少为10.6/100万，年发病率至少为2/100万[1]。由于治疗效果差和疾病不可逆性迅速进展，PH病死率居高不下[2]。若PH不及时控制，患者预期生存时间仅为2.8年[3]。所以研究PH的发病机制，探讨其治疗新靶点具有重要意义。PH的发生与遗传、个体、环境等多种因素相关，欧洲心脏病学会/欧洲呼吸病学会于2015年发布最新“肺动脉高压诊断和治疗指南”，将PH分为动脉性PH、左心疾病相关性PH、肺部疾病和(或)缺氧所致PH、慢性血栓栓塞性PH及机制不明和(或)多因素所致PH五大类[4]，但目前研究发现不同类型的PH存在共同的病理基础，其中肺小动脉重构是主要环节[5-6]。而肺血管内皮细胞损伤和凋亡、肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)异常增殖、炎性反应等因素共同参与了肺血管重构过程，其中又以炎性反应及PASMC异常增殖为PH肺小动脉重构的中心环节[7]。

近年来在PH动物模型中白细胞介素6(IL-6)信号调控在肺血管重构中的作用已成为PH研究热点[8]。GATA-6基因主要表达于血管平滑肌,其作用为抑制PASMC进入细胞周期，对维持静止期PASMC表型的稳定具有重要作用[9]；其通过稳定细胞表型来抑制PASMC异常增殖最终防止肺小动脉重构。因此，阐明GATA-6、IL-6与PH发病的相关性及GATA-6与IL-6的联系对寻找PH新的治疗靶点具有重要意义。

1 IL-6信号通路与PH的关系

1985年Kishimoto等从人T细胞中首先获得IL-6 cDNA克隆。人体IL-6主要来源于单核细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC),通过检测PH患者肺组织和血清中IL-6的表达水平显著升高，且单核巨噬细胞产生IL-6越多，动脉重构越迅速[10]。在未经PH造模的正常小鼠中，IL-6的过表达在低氧诱导下导致的肺动脉压力和肺血管阻力明显升高[11]，因而认为血清IL-6水平能预测PH患者预后[12-13]。

1.1 IL-6调控TGF-β/Smad信号通路在PH形成中的作用 转化生长因子(transforming growth factor, TGF)家族主要分为TGF-βs亚家族和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)亚家族，TGF-βs亚家族又分为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3种亚型，其中以TGF-β1活性最强。临床观察到PH患者TGF-βs信号亢进及在PH模型中发现编码BMPs的骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)基因突变,均会导致BMP信号减弱[14-15]。TGF-β1是一种抗炎细胞因子，在研究神经干细胞的过程中发现，它具有促进神经发育的作用，腓骨蛋白2(FBLN2)是在这一作用中的重要介质[16]，其通过TGF-β/Smad信号通路维持血管正常结构及调节炎性反应平衡。完整的Smad信号通路包括配体、膜受体、细胞质内信号转导分子和跨核膜转运信号分子，该通路中的任意一个表达环节异常均可导致血管重构[17]，但FBLN2主要表达于主动脉中层的动脉平滑肌细胞，是否为PASMC增殖导致PH的主要机制，目前尚不十分清楚。有研究发现，TGF-β1可刺激健康人近端和远端PASMC的增殖，从而促进自发性PH的形成[18-19]，其机制可能与TGF-β刺激PASMC IL-6生成显著增加有关，予IL-6抗体后可抑制TGF-β引起的PASMC增殖作用[20]。内皮素1(ET-1)是迄今为止发现的作用最强的缩血管因子,其可间接调控TGF-β1/Smad信号通路而发挥作用。内毒素血症时肺组织中的ET-1上调，能明显促进内毒素诱导的PH，其机制可能为ET-1激活G蛋白偶联的ETA和ETB受体，导致cAMP浓度增加，进而激活磷脂酶C和蛋白激酶C，使得环氧合酶2的表达水平上调，最终促进血管平滑肌收缩及VSMC增殖[21]。但随后研究表明，ET-1对PASMC的增殖作用需要在炎症介质的协同下完成，其可能是通过炎症介质激活MAPK-ERK1/2信号通路来实现的[22]。周细胞又称Rouget细胞，在肺动脉血管中周细胞参与内皮细胞的生长、增殖、分化等。在慢性缺氧条件下，周细胞可以转化为收缩型平滑肌细胞而发挥作用，而TGF-β协同IL-6可明显影响周细胞的这一作用，随后PH动物实验证实，TGF-β信号通路被激活后可加速PH的进展[23-24]。

1.2 IL-6通过调控p38MAPK信号传导导致PH形成 MAPKs是信号传导过程的重要介质，在各种生理和病理条件下均可被激活，研究发现野百合碱处理使得造模后的大鼠肺部p38MAPK表达明显上调，而后予选择性p38MAPK抑制剂则阻止了PH的进展[25]。已有研究表明，IL-6可通过激活p38MAPK细胞内通路刺激胎儿肺发育[26]。Fujita等[27]研究也发现，在MC3T3-E1细胞中凝血酶可通过激活p38MAPK信号通路参与IL-6的合成，该研究在很大程度上证实IL-6与p38信号通路有着直接关系。IL-6表达升高通过对p38信号通路的直接作用来调节PASMC凋亡和增殖，进而促进肺血管重构的发生，这在野百合碱诱导PH大鼠注射胸腺素可抑制肺血管重构的研究中得到进一步证实[28]。同时p38MAPK活性通路介导的IL-6与BMPs通路之间存在负反馈环，提示IL-6激活可能是家族性PH合并BMPR2突变的主要原因。

1.3 IL-6调控miR-17/92信号通路诱发PH的形成 miRNAs是一类高度保守的内源性小非编码RNA，在细胞增殖和分化过程中发挥重要作用，miR-17/92基因簇是第一个被发现的miRNA癌基因。研究表明，miR-17/92基因簇信号通路是PH在体内的关键调控因子，其在缺氧诱发PH中的表达成双向性(早期呈诱导性表达、晚期表达降低)[29]。在一组动物实验模型中发现，miR-17/92基因敲除小鼠可延缓缺氧诱发PH的进展，而再将miR-17/93基因重组到miR-17/93基因敲除小鼠中又加快了缺氧诱发PH的进展，且该实验还证实miR-17z92基因对TGFb/Smad通路有正调控作用[30]。所以目前国内外对IL-6在肺血管重构中作用的研究主要关注IL-6对miR-17/92信号通路是否有直接或间接的调控作用[31]。

1.4 IL-6通过STAT3信号通路诱发VSMC增殖 IL-6的经典信号通路传导与抗炎功能有关，而反式信号通路传导则与促炎功能有关，IL-6的反式信号通路可诱导单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)产生，但IL-6需激活STAT3通路才能诱导MCP-1的表达，MCP-1在人体主要为血管内皮细胞释放，其功能与内皮细胞炎症及增殖有关。近年来有研究报道，IL-6的高表达可上调STAT3表达，最终诱导PASMC过度增殖和凋亡导致PH的发生[32]。在野百合碱诱发PH的大鼠实验中发现，予野百合碱后2～4 d PY-STAT3过度激活，证实IL-6的表达与PY-STAT3激活程度呈正相关[33]，其机制可能是在IL-6刺激下STAT3的特异性酪氨酸残基出现磷酸化并聚合，然后通过细胞质扩散到核孔区域并导入细胞核，从而激活靶基因转录[34-36]。但目前该机制仅在癌细胞的增殖中得到证实，是否为PH的主要机制目前尚不清楚[37]。

2 IL-6调控基因启动子甲基化与GATA-6的关系

2.1 IL-6对基因启动子甲基化的作用 DNA甲基化是表观遗传学基因调控的一种形式，当甲基化发生在调控区域时，其与转录因子的改变通常会导致靶基因表达受抑制。通常DNA甲基化发生在鸟嘌呤前的胞嘧啶残基，即CpG岛，甲基在DNA甲基转移酶(Dnmts)催化下于CpG双重蛋白内的胞嘧啶残基中形成5甲基胞嘧啶而发挥作用，目前研究表明，DNA甲基化在胚胎发生和恶性肿瘤的生长中扮演着重要角色[38-39]。Dnmts是催化DNA甲基化的关键酶，包括Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b，其中Dnmt3a、Dnmt3b负责甲基化的建立，Dnmt1负责维持及修复DNA甲基化功能。DNA甲基化在IL-6介导的基因表达中发挥重要作用，其原因是IL-6通过诱导基因启动子区CpG岛的甲基化来下调靶基因的表达，导致靶基因沉默。既往研究发现，IL-6对Dnmt1启动子及Dnmt1酶活性的调节有直接作用[40]。在胰腺癌细胞的增殖过程中观察到，IL-6诱导的STAT3将Dnmt1集中到SOCS3启动子位点，通过DNA甲基化抑制其转录[41]；在血管内皮细胞的生成中也可观察到IL-6通过调控Dnmt1和Dnmt3b，从而诱导启动子DNA甲基化来影响血管内皮细胞基因的表达[42]。Wehbe等[43]发现，胆管癌的生长需甲基化依赖的IL-6调控基因参与，同时IL-6还可通过影响其他酶的表达或活性来间接参与基因甲基化和转录调控蛋白的表达。

2.2 GATA-6基因在PH形成中的作用 近年来，GATA转录因子家族在细胞增殖中的作用受到高度重视[44]。GATA家族具有两个特征性锌指结构和特定的核苷酸序列,按表达方式的不同被分为两个亚族。GATA-6是唯一表达于VSMC的GATA家族转录因子，由Tamura等[45]首次在兔胃组织中发现,其作用与调节PASMC表型转化有关，同时GATA-6可抑制细胞进入细胞周期，能维持静止期细胞表型的稳定性，即对平滑肌细胞的增殖与分化有重要的临床意义。

2.2.1 关于血管平滑肌表型的转化：1913年，Champy首次在体外培养出VSMC，并发现有2种功能截然不同的VSMC[46]，此后Chamley-Campbell等[47]提出两种不同功能的VSMC可能是其分化状态的两个极端，并首次提出表型转化的概念，即VSMC在来自胚胎发育时,首先分化为不同的细胞群并获得具有成年特征的收缩表型,主要功能是促进及稳定血管的正常生理活动；当分化成熟后的VSMC在内外环境因素刺激下可发生去分化,成为分化程度较低的合成表型,表现为VSMC异常增殖、迁移、凋亡等。我们把VSMC从收缩表型转化为合成表型并重获增殖能力的过程称为表型的转化。

2.2.2 GATA-6在维持血管平滑肌表型中的作用：VSMC收缩表型中标志基因的表达有赖于血清反应因子(SRF)与位于这些基因启动子和增强子内的CArG盒的结合，而SRF的表达又有赖于GATA-6的调控。在体外培养VSMC过程中发现，GATA-6 mRNA通过有丝分裂原的刺激和在增殖过程中过表达的GATA-6负反馈机制来实现细胞周期的阻滞，从而使VSMC生长停滞[48-49]。有数据表明，单独敲除GATA-6基因可使平滑肌细胞保持收缩表型的能力降低60%[48]。在敲除GATA-6基因的小鼠中可观察到肺动脉压力明显升高，并表现出血管肌化及肺部炎症加强[49]。GATA-6基因腺病毒转染平滑肌细胞的微点阵基因芯片分析表明，GATA-6转录因子也能激活ET-1的转录，促使血管平滑肌从收缩表型向合成表型转化[48]。现有研究表明，GATA-6的表达对肺血流动力学的影响尤其重要，GATA-6的下调能明显提高肺动脉压力，而对动脉压的增加无明显作用，同时在野百合碱致大鼠缺氧模型和慢性缺氧小鼠模型中观察到从损伤后第3天起肺GATA-6 mRNA水平便迅速下降，表明GATA-6表达变化可能是引起PH血管重构的早期病理过程[50]。在PH患者中，内皮细胞是CX3CL1的主要来源，而CX3CL1是大鼠GATA-6缺陷的血管内皮细胞中显著上调的基因之一[51]，表明GATA-6的下调可能直接导致了炎性反应的发生。所以GATA-6在维持VSMC收缩表型的稳定性及调控VSMC的发育和分化中发挥重要作用。

2.3 IL-6与GATA-6可能的潜在关系 既往证据表明，平滑肌细胞DNA是否甲基化在血管平滑肌表型转化中发挥重要作用，而表型的转化决定着VSMC是否进行增殖[52]。虽然GATA-6在维持VSMC收缩表型的稳定性及调控VSMC的分化中发挥重要作用，但是IL-6诱导GATA-6启动子区CpG岛甲基化最终引起VSMC增殖/凋亡异常可阻断这种作用。但目前IL-6诱导GATA-6启动子区CpG岛甲基化引起靶基因沉默来参与PASMC异常增殖这一机制还未被完全证实。

3 前景与展望

关于PASMC异常增殖，国内外已有学者开始研究IL-6在肺血管重构中的促进作用，但主要关注IL-6对信号通路的调控，而在炎症状态下，PASMC通过直接接受IL-6的刺激，并经IL-6对GATA-6基因启动子进行甲基化修饰，使GATA-6失去对下游增殖及凋亡基因的调控，从而在PH肺血管重构中起重要作用的研究目前国内外尚未见报道。所以研究IL-6信号通路调控GATA-6基因启动子甲基化在PASMC异常增殖中的作用尤为重要，这将为确定PH的发生机制和新的治疗靶点提供理论基础。