乙型肝炎病毒表面抗原阳性的乙型肝炎病毒感染患者行异基因造血干细胞移植的疗效观察

刘金霞 张耀臣 庞宇慧 王荣孝 曹建柱 翟晓冉 张娜 李建英

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治愈血液病的重要方法之一，目前尚无治疗药物能彻底清除乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和肝细胞内HBV-DNA，达到完全治愈乙型病毒性肝炎(简称乙肝)的目的。本研究纳入30例行allo-HSCT的血液病患者，将其分为有HBV感染的HBsAg(+)组与供受者均为HBV免疫标志物阴性的HBsAg(-)组，比较两组患者粒系和巨核系造血重建时间、移植后肝功能，观察HBsAg(+)的HBV感染患者行allo-HSCT后HBV免疫标志物[乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)、乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)]的变化。现报道如下。

对象与方法

1.对象：2016年4月～2019年1月于我科行亲缘allo-HSCT的血液病患者82例，包括异基因全相合20例，异基因半相合62例，将其中10例HBV感染且HBsAg(+)HBcAb(+)者作为HBsAg(+)组，男4例，女6例，年龄21～51岁，平均年龄(36.30±11.02)岁，病程8个月～3年11个月；其中急性髓系白血病(AML)4例、急性淋巴细胞白血病(ALL)2例、多发性骨髓瘤(MM)1例、再生障碍性贫血(AA)2例、骨髓增生异常综合征(MDS)1例，3例有乙肝家族史，4例移植前HBV-DNA(+)；10例供者中，人类白细胞抗原(HLA)全相合且HBsAb(+)3例，HLA半相合且HBsAb(+)1例，HLA半相合且HBsAb(+)HBcAb(+)1例，HLA全相合且HBsAg(+)2例，HLA半相合且HBsAg(+)1例，HLA半相合且HBsAg(-)HBsAb(-)HBcAb(-)2例。将年龄、性别、疾病类型和预处理方案等其他情况与HBsAg(+)组相似,但供者和受者均为HBsAg(-)HBsAb(-)HBcAb(-)的患者20例作为HBsAg(-)组,其中男8例,女12例，年龄7～60岁，平均年龄(27.10±15.10)岁,HLA全相合6例。两组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有患者均签署知情同意书。

2.方法

(1)干细胞移植类型：均为亲缘allo-HSCT，采用骨髓+外周血干细胞联合输注。骨髓造血干细胞输注前1天为-1 d，骨髓造血干细胞输注当天定义为移植01 d，外周血造血干细胞输注当天定义为移植02 d，造血干细胞回输后第1天为+1 d，以后依次递推，临床随访时间为移植后至患者死亡或截止至2019年1月。

(2)预处理方案：AA：抗人T细胞兔免疫球蛋白(ATG)+环磷酰胺(Cy)+氟达拉滨(Flu)；MDS：白消安(BU)+Cy+FLu+ATG；标危AML、ALL、MM：全身照射(TBI)+ATG+Cy+阿糖胞苷(Arac)+Flu+司莫司汀(Me-CCNU);高危AML、ALL、MM：在标危方案基础上加用去甲氧柔红霉素(IDA)+羟喜树碱(HCPT);以上方案中药物使用方法为：TBI 500cGy×2 d；BU 3.2 mg·kg-1·d-1×1 d；Cy 50 mg·kg-1·d-1×2 d(除AA×4 d、MDS×4 d外)；法国兔ATG 2.5 mg·kg-1·d-1×4 d；Flu 30 mg·(m2)-1·d-1×5 d；Arac 4 g·(m2)-1·d-1×2 d；Me-CCNU 250 mg·(m2)-1·d-1×2 d；IDA 8 mg·(m2)-1·d-1×2 d；HCPT 5 mg/d×2 d。

(3)移植物抗宿主病(GVHD)预防：两组患者均进行GVHD预防，方案为他克莫司(FK506)+甲氨蝶呤(MTX)+吗替麦考酚酯(MMF)±巴利昔单抗，具体用法如下：FK506 0.02 mg·kg-1·d-1静脉滴注，待患者能够口服时改为2 mg每日2次，高危患者3～4个月停用，标危患者4～6个月停用，AA患者9～12个月停用。HLA全相合患者给予MTX 15 mg·(m2)-1·d-1静脉推注，+1 d，10 mg·(m2)-1·d-1静脉推注，+3 d、+6 d；HLA半相合患者给予MTX 15 mg·(m2)-1·d-1静脉推注，+1 d，10 mg·(m2)-1·d-1静脉推注，+3 d、+6 d、+11 d。MMF 0.5 g每日2次口服，+28 d停药。HLA半相合患者加用巴利昔单抗20 mg静脉滴注，+1 d、+8 d。急性肝脏GVHD诊断和分级采用西雅图诊断标准，慢性肝脏GVHD诊断参照美国国家卫生研究所(NIH)专家共识标准[1]：血清总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)均>正常参考值范围上限值2倍，AST或ALT均>正常参考值范围上限值2倍，排除由药物反应、肝静脉闭塞症(HVOD)、感染等导致的肝功能损害。GVHD临床症状出现后积极加用甲泼尼龙琥珀酸钠治疗。

(4)HVOD预防：前列地尔0.3 μg·kg-1·d-1静脉注射，自-1 d开始至+28 d。

(5)HBV感染防治方案：HBsAg(+)组10例患者中，2例口服拉米夫定100 mg/d，7例口服恩替卡韦50 mg/d，1例口服拉米夫定100 mg/d联合恩替卡韦50 mg/d，ALT或AST均≤正常参考值范围上限值2倍后再行allo-HSCT，于-1 d、01 d、02 d均给予乙肝人免疫球蛋白400 IU肌注。自预处理开始输注复方甘草酸苷、多烯磷脂酰胆碱护肝。

(6)观察指标：移植前10 d内常规检测供者和受者血常规、HBV免疫标志物、HBV-DNA及肝功能(ALT、AST、TBIL)，移植后平均每周二、周五随访患者血常规、ALT、AST、TBIL至移植后6个月，每4～6周检测1次HBV免疫标志物和HBV-DNA，直至移植后3个月，以后每3～6个月检查1次。采用速率法检测ALT和AST，正常参考值范围分别为9～50 U/L、15～40 U/L，采用终点比色法检测TBIL，正常参考值范围为5.1～20.1 μoml/L。采用化学发光法检测HBV免疫标志物；使用聚合酶链反应(PCR)试剂盒定量检测HBV-DNA，最低检测敏感度为5×102copies/ml。造血重建判断标准：脱离PLT输注后连续7 d的PLT计数均≥20×109/L为巨核系造血重建；连续3 d中性粒细胞计数绝对值均≥0.5×109/L为粒系造血重建。通过检测患者移植后供体嵌合率评估供者细胞在受者体内的嵌合状态进一步获得供体细胞植入程度的实验室证据。

结 果

1.两组患者的造血重建时间比较：两组患者在行allo-HSCT后均获得造血重建。HBsAg(+)组与HBsAg(-)组患者粒系重建时间[(12.55±0.93)d比(13.75±2.34)d，t=1.55，P=0.13]、巨核系重建时间[(18.30±4.62)d比(26.35±20.15)d，t=1.24，P=0.23]比较差异均无统计学意义。

2.两组患者移植前后肝功能比较：HBsAg(+)组移植前4例患者肝功能异常，其中ALT升高2例(分别为46 U/L、54 U/L)，TBIL升高2例(分别为47.0 μoml/L、43.1 μmol/L)；移植后8例患者肝功能异常，ALT和TBIL均升高，其中6例为药物性肝损害，2例为急性肝脏GVHD：1例为女性ALL患者病情复发化疗后未缓解，发生GVHD Ⅲ度，给予甲泼尼龙20 mg/d治疗2周后GVHD缓解；1例患者为GVHD Ⅳ度，给予甲泼尼龙40 mg/d治疗4周后GVHD缓解。未发生HVOD、肝衰竭、病毒性肝炎爆发等严重并发症。HBsAg(+)组患者ALT峰值为87.10(60.83，448.48)U/L，峰值发生时间为+(22.25±13.85)d，ALT均一过性升高，TBIL峰值为58.00(47.83，98.25)mmol/L，峰值发生时间为+(24.38±13.2)d，此后对HBsAb转阳的受者追踪观察(16.20±9.68)个月，HBsAb均高滴度存在，ALT、AST、TBIL等指标均正常。HBsAg(-)组移植前9例患者肝功能异常，ALT升高4例(分别为40.9 U/L、50.2 U/L、59.9 U/L、64.2 U/L)，TBIL升高3例(分别为31.0 μmol/L、37.0 μmol/L、40.9 μmol/L)，ALT和TBIL均升高2例，分别为61.2 U/L、52.3 U/L和42.3 μoml/L、37.2 μoml/L；移植后14例患者肝功能异常，其中ALT升高1例，ALT和TBIL均升高13例，ALT峰值为89.20(72.13，226.40)U/L，峰值发生时间为+(24.38±13.20)d，TBIL峰值为43.00(28.00，63.43)mmol/L，峰值发生时间为+(29.35±15.61)d，其中10例为药物性肝损害，3例为肝脏GVHD Ⅰ度，1例为肝脏GVHD Ⅲ度，治疗后均缓解。HBsAg(+)组和HBsAg(-)组患者移植前后肝功能异常率比较差异均无统计学意义(40.0%比42.5%，χ2=0.02，P=0.90；80.0%比70.0%，χ2=0.02，P=0.88)。

3.HBsAg(+)组患者HBV免疫标志物及HBV-DNA变化情况:HBsAg(+)组中，6例患者接受HBsAg(-)HBsAb(+)供者的干细胞后，5例实现了HBsAg转阴、HBsAb转阳的血清学转化，其中3例HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)大三阳患者[2例供者HBcAb(+)、1例供者HBcAb(-)]移植后HBeAg均转阴，2例HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)小三阳患者[其中1例有乙肝家族史患者接受了HBcAb(-)供者的干细胞]移植后HBeAb均转阴。3例发生HBV血清学转化的大三阳患者中，移植前2例HBV-DNA(+)，移植后HBV-DNA转阴时间分别为+35 d、+60 d，此3例患者分别于+60 d、+90 d、+45 d出现HBsAb，分别于+60 d、+120 d、+90 d HBsAg消失，分别于+60 d、+120 d、+75 d HBeAg消失。移植前4例受者HBV-DNA(+)，移植后仅1例大三阳患者HBV-DNA持续未转阴，其余9例HBV-DNA均为阴性。

讨 论

造血干细胞移植是对患者进行TBI、化疗和免疫抑制处理后，将正常供体或自体的造血细胞输入患者体内，使之重建正常造血和免疫功能以治愈疾病[2]。随着单倍体移植技术的开展，allo-HSCT目前已成为治疗血液病、部分实体肿瘤、风湿免疫性疾病、儿科代谢性疾病的有效方法。但造血干细胞易受多种病毒的感染和影响。我们对HBsAg(+)的10例HBV感染者allo-HSCT前后均给予抗病毒治疗，allo-HSCT后造血干细胞均顺利植活，植活时间与对照组比较差异无统计学意义，提示HBV慢性感染不影响造血干细胞植入，与费新红等[3]报道一致，该研究对伴有HBV感染的血液病患者造血干细胞移植前进行有效抗病毒治疗及造血重建后服用拉米夫定和(或)阿德福韦/恩替卡韦治疗，发现进行allo-HSCT是安全的，不影响患者造血重建。其机制可能与HBV慢性感染者已形成免疫耐受，不能对感染HBV的细胞(包括肝细胞、造血干细胞、外周血单个核细胞等)形成有效的免疫应答有关。

造血干细胞移植后患者易出现肝细胞受损，表现为肝功能异常，常见原因包括HBV感染、肝脏GVHD、药物性肝损害，尤其是携带HBV的血液病患者应用化疗或免疫抑制剂治疗后可诱发HBV激活，发生急性肝脏炎症甚至进展为肝硬化或肝功能衰竭。既往有免疫抑制剂致HBV再激活导致患者死亡的报道[4]。张仁忠等[5]的研究结果显示，HBV感染的恶性肿瘤患者在接受化疗时会出现HBV激活的情况，HBV激活患者的肝功能损害更为严重，糖皮质激素类和蒽环类药物是影响HBV激活的高危因素。本研究中，HBV感染患者在回输造血干细胞前均需要大剂量化疗甚至放疗预处理，allo-HSCT前有4例患者存在轻度肝功能异常，allo-HSCT后有8例患者出现不同程度的肝功能受损。在抗HBV前提下行allo-HSCT，有2例患者发生肝脏GVHD，但未发生肝衰竭及因肝脏并发症死亡情况，提示在使用免疫抑制剂前或同时给予抗HBV治疗可减少HBV激活、肝脏损伤及肝衰竭的发生，降低移植后死亡率[6]。对于移植前肝功能受损严重、HBV-DNA载量高但给予抗病毒和保肝药物治疗后肝功能改善、HBV-DNA载量下降及移植前轻度肝功能受损、HBV-DNA(-)的HBV感染患者，可耐受化疗预处理进行造血干细胞移植。

HBV感染的治愈标准是HBsAg转阴、HBV-DNA持续检测不到、HBeAg转阴伴或不伴HBsAb转阳，目前所有的抗HBV药物均可抑制HBV复制，但难以彻底清除HBV以治愈乙肝。本研究中有5例供者为HBsAb(+)的受者均实现了HBsAg转阴，而供者为HBsAb(-)的受者均未出现HBsAg转阴、HBsAb转阳，可见供者HBsAb(+)是受者HBsAg转阴的重要因素，可能与供者主动或被动获得的细胞免疫及体液免疫过继给受者有关。HBeAg是HBV感染和复制的标志之一，因其可诱导T淋巴细胞对感染的免疫耐受性，使HBV逃避人体免疫系统对其进行清除，导致HBV持续感染。既往研究报道，ALT水平间接反映机体免疫应答的强弱，而免疫应答是清除HBeAg的关键；肝脏炎症反应越重，表明免疫应答越强，越有利于清除HBeAg；基线AST与PLT比值指数(APRI)评分及TBIL水平较高的HBeAg(+)慢性乙肝患者可获得较高的HBeAg转阴率[7]。亦有多项研究报道，基线ALT水平与血清学HBeAg转阴率相关，且基线ALT水平联合24周HBV-DNA水平可预测后期HBeAg血清学转换率[8-10]。本研究中有3例HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)大三阳受者移植后发生HBsAg转阴、HBsAb转阳，移植后均有不同程度ALT水平异常，2例移植后HBV-DNA转阴者均发生在HBeAg转阴之前。但本研究中有2例供者为HBsAb(+)HBcAb(-)的受者也实现了HBsAg转阴，与既往报道不同：Lau等[11]的研究中，7例供者均为HBsAb(+)HBcAb(+)，而受者均为HBV携带者，移植后4例HBsAg转阴，而供者为HBsAb一项阳性的受者均未出现HBsAg转阴，并证明了接受HBsAb(+)HBcAb(+)供者干细胞移植后发生HBV清除是供者T淋巴细胞所致。因此，输注多种HBV抗原疫苗激活HLA相匹配的供者淋巴细胞可能是一种有效的过继免疫治疗乙肝的方法。受者在输注供者骨髓及外周血干细胞同时也会将大量白细胞、红细胞、血小板输入体内，类似于换血疗法，多次换血疗法即多次放血后输注同血型HBsAb(+)供者的全血能否实现HBsAg(-)HBsAb(+)值得临床探索。

综上所述，HBV感染对allo-HSCT后粒系和巨核系造血重建时间无明显影响，对移植后肝功能影响较小，移植前或同时给予抗病毒及保肝治疗可以安全进行造血干细胞移植，尤其是HBV感染受者接受HBsAb(+)供者的造血干细胞有助于实现HBsAg转阴并产生HBsAb，但对于HBsAg(+)受者接受HBsAb(+)供者的造血干细胞后，HBsAg转阴机制尚待进一步研究，转阴机制一旦明确，相信对于慢性乙肝患者的治愈方法会有新的突破。