白藜芦醇对哮喘小鼠气道炎症及肺组织高迁移率族蛋白B1和基质金属蛋白酶-9表达的影响

邹进晶 查干 王有娜 索涛 吴小军

哮喘是多种免疫活性细胞和细胞因子参与的一种慢性非特异性气道炎症性疾病[1-2]。既往研究结果显示，辅助性T细胞(Th)1/Th2和Th17/调节性T细胞(Treg)反应失衡是哮喘免疫失衡的主要机制，然而其作用通路还不足以完全解释哮喘患者症状的持续存在[3-4]。白藜芦醇(RES)是植物在环境恶化及受到病原攻击时产生的一种植物抗毒素。既往研究表明，RES在哮喘[5]、慢性阻塞性肺疾病[6]、急性肺损伤[7]及肺间质性病变[8]等呼吸系统疾病中发挥重要作用。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种晚期炎症因子，已有研究证实其在维持哮喘气道炎症中发挥作用[9]。基质金属蛋白酶(MMP)-9通过促进细胞外基质(ECM)沉积和气道平滑肌细胞增殖、迁移，参与哮喘的气道重塑过程[10]。我们通过检测RES对哮喘小鼠模型气道炎症反应及肺组织HMGB1和MMP-9表达的影响，探讨其影响哮喘气道炎症的机制，为支气管哮喘患者的治疗提供新思路和理论基础。

材料与方法

1.材料：6～8周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠36只，体重约20 g，购于武汉大学动物实验中心。鸡卵清蛋白(OVA)购于Sigma公司；免疫组化一抗购于美国Gene Tex公司；二抗及显色剂购于北京博奥森生物技术有限公司。逆转录试剂盒和聚合酶链反应(PCR)试剂盒购于Transgene公司；Trizol总RNA提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生科有限公司；ECL发光液购于美国Thermo Scientific公司。实验仪器包括超声雾化器、实时定量PCR仪(ABI7500型)、光学显微镜等。

2.方法

(1)动物分组和哮喘小鼠模型制作：将36只C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组、哮喘组及RES干预组，每组各12只。哮喘小鼠模型制作：①致敏:于第1天、第14天予每只小鼠分别腹腔注射致敏液0.2 ml(1 mg/ml OVA 0.1 ml与10 mg/ml佐剂液态铝0.1 ml混合制备)；②激发:于第21～27天将小鼠置于密闭容器(20 cm×40 cm×50 cm)中，以10 mg/ml的OVA溶液10 ml雾化吸入，每天1次，每次30 min；同时，RES干预组小鼠于激发前1 h，采用100 mg/kg的RES腹腔注射进行干预；对照组和哮喘组小鼠腹腔注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。末次激发24 h后处死动物，进行标本采集。

(2)肺组织标本制备：第28天断椎处死各组小鼠，并立即予PBS进行肺泡灌洗，收集1ml肺泡灌洗液于EP管中，迅速取新鲜右肺组织置于1.5 ml的EP管中，置于-80 ℃冰箱贮存。将取出的左肺组织置于4%甲醛溶液中，石蜡包埋固定切片后，行苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸-雪夫(PAS)染色及免疫组化染色。

(3)HE染色、PAS染色及免疫组化染色：每只小鼠分别随机选取3张肺组织石蜡切片行HE和PAS染色。评分方法：两位独立的观察者在200倍显微镜下对支气管壁炎症细胞浸润及杯状细胞的增殖情况进行半定量评分，每张切片至少观察4个视野，评分标准：0分：支气管壁及血管周围无炎症细胞浸润；1分：支气管壁及血管周围有散在炎症细胞浸润；2分：支气管壁及血管周围有1～5层炎症细胞浸润；3分：支气管壁及血管周围有>5层炎症细胞浸润。采用Image Pro Plus 6.0软件分析气道上皮杯状细胞的数量及基底膜周径标准化的PAS+杯状细胞面积(Apas+/Pbm)。每张石蜡切片也均进行免疫组化染色，观察炎症细胞中HMGB1和MMP-9蛋白的表达，采用积分光密度(IOD)反映目标蛋白的表达水平。

(4)肺组织HMGB1和MMP-9 mRNA的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测：采用Trizol法提取右肺组织总RNA，采用逆转录试剂盒合成单链cDNA，并设计目的基因引物。HMGB1序列上游引物:5’-AAAGAAGTTCAAGGACCCC-3’，下游引物:5’-GCTCTGTAGGCAGCAATAT-3’,产物长度234 bp；MMP-9序列上游引物:5’-GCGTGTCTGGAGATTCGACT-3’,下游引物:5’-TTTGGAAACTCACACGCCAG-3’，产物长度167 bp；内参GAPDH上游引物：5’-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3’,下游引物:5’-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3’，产物长度229 bp;PCR反应体系(20 μl)：模板cDNA 4 μl，PCR上、下游引物(100 μM)各0.4 μl，预混缓冲液(SYBR Greenn/Flourescein qPCR Master)10 μl，双蒸水(ddH2O)5.2 μl。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个样品重复3次,记录每次测定的Ct值，以GAPDH为内参，得出的数据采用2-△△Ct进行分析。

(5)支气管肺泡灌洗液(BALF)中HMGB1和MMP-9蛋白水平检测：将保存在-80 ℃冰箱中的BALF取出，于冰上复融后在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HMGB1和MMP-9蛋白水平。

结 果

1.3组小鼠肺组织病理形态学比较：对照组小鼠肺组织HE染色下见支气管结构排列规律，未见炎症胞浸润(图1A)；PAS染色下见支气管上皮细胞中几乎无杯状细胞(PAS+细胞)和黏液分泌(图1B)。哮喘组小鼠肺组织HE染色下见气道壁明显增厚，肺泡融合，支气管壁和血管周围有大量炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主(图1C)；PAS染色下见支气管上皮细胞中杯状细胞(PAS+细胞)增殖及黏液分泌明显增多(图1D)。与哮喘组比较,RES干预组小鼠肺组织HE染色下见气道壁明显变薄、肺泡融合明显减少，支气管壁和血管周围炎症细胞明显减少(图1E)；PAS染色下见支气管上皮细胞中杯状细胞(PAS+细胞)数量和黏液分泌明显减少(图1F)。对照组、哮喘组和RES干预组小数肺组织炎症病理学评分分别为0.33±0.18、2.68±0.39、1.51±0.54，Apas+/Pbm分别为0.41±0.44、6.01±1.28、3.54±1.59。RES干预组小鼠肺组织炎症病理学评分和Apas+/Pbm均明显低于哮喘组(P<0.05)。

2.3组小鼠肺组织中HMGB1和MMP-9蛋白免疫组化及mRNA检测结果比较：对照组小鼠肺组织中HMGB1和MMP-9蛋白及mRNA的表达较少，而哮喘组小鼠肺组织中的表达明显增多，但RES干预组HMGB1和MMP-9蛋白及mRNA的表达水平均明显低于哮喘组(P<0.05)。见图2和表1。

表1 3组小鼠肺组织中HMGB1和MMP-9 mRNA及蛋白表达水平比较

3.3组小鼠BALF中炎症细胞计数、HMGB1及MMP-9蛋白表达水平比较：哮喘组小鼠BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞计数、巨噬细胞计数、淋巴细胞计数、HMGB1及MMP-9表达水平均高于对照组(P<0.05)；RES干预组小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞计数、巨噬细胞计数、淋巴细胞计数、HMGB1及MMP-9表达水平均低于哮喘组(P<0.05)。见表2。

图1 3组小鼠肺组织病理形态学比较(×200，A:对照组，HE染色；B：对照组，PAS染色；C:哮喘组，HE染色；D:哮喘组，PAS染色；E：RES干预组，HE染色；F：RES干预组，PAS染色)

图2 3组小鼠肺组织中HMGB1和MMP-9蛋白免疫组化结果(×200，A、D:对照组；B、E:哮喘组；C、F:RES干预组)

表2 3组小鼠BALF中炎症细胞计数、HMGB1及MMP-9蛋白表达水平比较

讨 论

既往研究结果显示，RES可减轻慢性哮喘小鼠气道炎症，并改善其气道重塑、降低气道高反应性、改善肺功能[11]。Lee等[12]的研究表明，RES干预哮喘小鼠模型组血清和BALF中Th2相关细胞因子分泌明显减少，气道炎症细胞数量及气道黏液分泌明显减少。本研究结果显示，与哮喘组比较，RES干预组小鼠支气管壁明显变薄，支气管壁及血管周围炎症细胞也明显减少，BALF中炎症细胞、支气管上皮杯状细胞数量及分泌的黏液也明显减少。因此，从肺组织炎症病理学评分和Apas+/Pbm角度而言，RES明显减轻哮喘小鼠气道炎症，但其具体机制尚未明确。

HMGB1广泛存在于哺乳动物细胞内，当机体免疫炎症反应被激活时，细胞内的HMGB1释放到细胞外[13]。Ma等[14]的研究表明，细胞外HMGB1参与Th2为主导的免疫炎症反应，诱导哮喘小鼠模型BALF中炎症细胞数量明显增加，同时细胞外HMGB1水平与哮喘的严重程度呈正相关，且该研究还认为HMGB1是激素抵抗型哮喘的潜在病因之一。Hou等[15]的研究也表明，哮喘患者肺活检标本及诱导痰液中HMGB1水平明显升高，且与BALF中性粒细胞数量呈正相关，与肺功能呈负相关。有研究表明，给予抗HMGB1功能性抗体干预后哮喘小鼠模型HMGB1的表达明显减少，哮喘症状明显减轻[16]。本研究结果显示，与对照组比较，哮喘组小鼠BALF中HMGB1蛋白及肺组织中HMGB1蛋白和mRNA表达水平明显升高；而RES干预组小鼠BALF中HMGB1蛋白及肺组织中HMGB1蛋白和mRNA表达水平明显低于哮喘组。因此，我们推测RES可能通过降低HMGB1的表达抑制哮喘气道炎症的发生。

MMP-9是与哮喘气道重塑关系最密切的MMPs成员。Royce等[17]的研究发现，RES可通过抑制上皮下胶原沉积减轻慢性哮喘小鼠气道重塑。本研究结果显示，与哮喘组比较，RES干预组小鼠BALF中MMP-9蛋白及肺组织中MMP-9蛋白和mRNA表达水平明显低于哮喘组。因此，我们推测RES可能通过调节MMP-9表达抑制哮喘小鼠气道重塑。

综上所述，RES可减轻哮喘小鼠气道炎症和气道重塑，其可能机制为通过调节HMGB1和MMP-9的表达。