SNHG1靶向调控miR-145对神经母细胞瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

周栩平，魏 琛

1)驻马店市中心医院新生儿及NICU科 河南驻马店 463000 2)郑州大学第三附属医院儿内科 郑州 450052

神经母细胞瘤是常见的恶性实体肿瘤，其发生机制十分复杂，放疗、手术切除、化疗等是其治疗的三大手段，但治疗效果仍不能令人满意[1]。基因靶向治疗是近年来的研究热点，探讨肿瘤分子发生机制是寻找有效靶基因的基础。LncRNA是长度大于200 nt的非编码RNA，不仅参与调控正常生理过程，还与很多疾病有关[2-3]。核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1,SNHG1)是lncRNAs中的重要一员，存在于人体组织中，与肿瘤的发生、淋巴结转移、病理分期等有关[4-7]。SNHG1在神经母细胞瘤组织中高表达,与患者的预后关系密切[8]。我们采用Starbase生物信息学软件发现SNHG1与miR-145有互补结合位点。miR-145能够抑制神经母细胞瘤的进展，在神经母细胞瘤组织中表达下调[9]。我们利用shRNA技术下调神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中SNHG1的表达，观察细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化，为基因靶向治疗神经母细胞瘤提供参考。

1 材料与方法

1.1材料SK-N-SH细胞购自美国ATCC。RPMI 1640购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国Gibco公司。SNHG1 shRNA和阴性对照shRNA由湖南丰晖生物科技有限公司合成，miR-145模拟物及阴性对照、miR-145抑制物及阴性对照由苏州吉玛基因药物科技有限公司合成，Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。One Step SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，7500 Real-time PCR系统购自美国Applied Biosystems公司，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。SpectraMax iD3 多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司；Transwell小室购自美国Corningcostar公司，孔径为8 μm。MMP-2抗体购自上海酶联生物科技有限公司，MMP-9抗体购自北京义翘神州生物技术有限公司。

1.2下调SNHG1表达对SK-N-SH细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响

1.2.1 实验分组 SK-N-SH细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，细胞融合度为80%时，用Lipofectamine2000将SNHG1 shRNA(sh-SNHG1组)或阴性对照shRNA (sh-NC组)分别转染入细胞中，转染步骤按照说明操作。以未转染细胞为空白对照组。分组处理24 h后进行指标检测。

1.2.2 细胞中SNHG1 mRNA的表达 采用qRT-PCR法。分别收集3组细胞，Trizol法提取总RNA，反转录得cDNA。反转录条件：42 ℃孵育5 min，95 ℃孵育10 s。反转录体系：Randam 6 mers、Oligod T primer、Prime Script Enzyme MixI各1 μL，4×Prime Script Buffer 4 μL，总RNA 2 μL，加RNase Free ddH2O补足至20 μL。PCR反应体系：2×SYBR Green PCR buffer 12.5 μL，上、下游引物各12 μL，添加ddH2O至25 μL。PCR条件：95 ℃孵育5 s，60 ℃孵育30 s，共40个循环。按照2-ΔΔCT法计算SNHG1 mRNA表达水平。引物序列：SNHG1上游5’-TA ACCTGCTTGGCTCAAAGGG-3’，下游5’-CAGCCTG GAGTGAACACAGA-3’；内参β-actin上游5’-CAAT GCTTCATAGGCGGACT-3’， 下游5’-ATGCTATCAC CTCCCCTGTG-3’。实验重复3次。

1.2.3 细胞增殖能力 采用CCK-8法检测。分别接种3组细胞到96孔板，细胞密度为4 000个/孔，每组3个复孔。用含有体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h，然后每孔添加CCK-8溶液10 μL继续培养2 h，用酶标仪检测450 nm波长处的OD值，以OD值表示细胞增殖能力。

1.2.4 细胞侵袭和迁移能力 采用Transwell小室法检测。侵袭实验前将基质胶用RPMI 1640按照1∶10稀释，然后吸取100 μL添加到小室的上室。其余侵袭和迁移实验步骤相同，简述如下：将3组细胞以2×104个/mL的密度添加到上室，每孔100 μL，然后在下室加入含有胎牛血清的细胞培养液。培养24 h后取出Transwell小室，用多聚甲醛固定15 min，用结晶紫染色30 min。使用棉签把没有穿膜的细胞擦掉，在200倍镜下随机选择5个视野观察，计数细胞，结果取5个视野的平均值。实验重复3次。

1.2.5 细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表达 采用Western blot法检测。分组培养24 h后，提取细胞中的总蛋白行SDS-PAGE。蛋白分离完成后冰上转膜，将NC膜依次放在封闭液(室温2 h)、一抗(室温1.5 h)、二抗(室温1.5 h)反应液中孵育。一抗均以1∶600稀释，二抗以1∶2 000稀释。ECL法显色，用Image J扫描、测定条带的灰度值。目的蛋白表达水平=目的条带灰度值/内参β-actin条带灰度值。实验重复3次。

1.3SNHG1与miR-145靶向关系的预测和鉴定采用Starbase生物信息学软件发现SNHG1与miR-145有互补结合位点。利用双荧光素酶报告实验鉴定两者的靶向关系。将SNHG1突变型荧光素酶报告载体(SNHG1-MUT)、野生型荧光素酶报告载体(SNHG1-WT)分别同miR-145模拟物、模拟物阴性对照共转染到SK-N-SH细胞中，检测荧光素酶活性。荧光素酶报告载体由南京科佰生物科技有限公司构建。

1.4miR-145抑制物对SNHG1表达下调的SK-N-SH细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响将SNHG1 shRNA、miR-145抑制物共转染到SK-N-SH细胞中(Sh-SNHG1+anti-miR-145组)，将SNHG1 shRNA、抑制物阴性对照共转染到SK-N-SH细胞中(Sh-SNHG1+anti-NC)。按照1.2中的方法检测细胞的增殖、侵袭、迁移能力，以及细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表达。采用qRT-PCR方法检测miR-145的表达，步骤同上。miR-145引物序列：上游5’-GGCTGGATGCAGAAGAG-3’， 下游5’-GCCTTCT TCTTGAACCCTCA-3’；内参U6引物序列：上游5’-TCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0分析实验数据。

空白对照、sh-NC、sh-SNHG1组细胞增殖能力、侵袭细胞数、迁移细胞数、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的比较采用单因素方差，组间两两比较采用LSD-t检验；2组细胞荧光素酶活性、miR-145表达水平、增殖能力、侵袭细胞数、迁移细胞数和MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的比较采用两独立样本的t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1空白对照、sh-NC、sh-SNHG1组细胞中SNHG1mRNA表达水平的比较见表1。sh-SNHG1组细胞中SNHG1 mRNA表达水平较空白对照、sh-NC组降低(P<0.05)。

2.2空白对照、sh-NC、sh-SNHG1组细胞增殖、侵袭和迁移能力及MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的比较见图1、表1。与空白对照、sh-NC组比较，sh-SNHG1组细胞增殖能力、侵袭和迁移能力降低，细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平也下降(P<0.05)。

1：空白对照组；2：sh-NC组；3：sh-SNHG1组

表1 3组细胞增殖能力、侵袭细胞数、迁移细胞数、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的比较(n=3)

2.3SNHG1与miR-145靶向关系的鉴定生物信息学软件预测SNHG1与miR-145有互补结合位点(图2)。双荧光素酶报告实验结果(表2)显示，SNHG1靶向负调控SK-N-SH细胞中miR-145的表达。

图2 生物信息学软件预测的SNHG1与miR-145的互补结合位点

表2 荧光素酶活性(n=3)

2.4miR-145抑制物对SNHG1表达下调的SK-N-SH细胞中miR-145、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响见图3和表3。与sh-SNHG1+anti-NC组比较，sh-SNHG1+anti-miR-145组细胞miR-145表达水平降低，MMP-2和MMP-9表达增强。

2.5miR-145抑制物对SNHG1表达下调的SK-N-SH细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响见表3。与Sh-SNHG1+anti-NC组比较，Sh-SNHG1+anti-miR-145组细胞增殖、侵袭和迁移能力均增强。

1：sh-SNHG1+anti-NC组；2：sh-SNHG1+anti-miR-145组

表3 sh-SNHG1+anti-NC和sh-SNHG1+anti-miR-145组细胞miR-145表达、增殖能力、侵袭细胞数、迁移细胞数、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的比较(n=3)

3 讨论

肿瘤转移是患者死亡和肿瘤复发的重要事件，肿瘤转移与细胞内的基因异常表达有关。研究[8，10-12]已证实，SNHG1在神经母细胞瘤组织中表达上调；其在宫颈癌组织中高表达并具有促进宫颈癌细胞恶性生长和侵袭的作用；后续在骨肉瘤、鼻咽癌等肿瘤细胞恶性生物学行为中同样发现SNHG1的促癌作用。在肿瘤转移过程中，细胞外基质降解为肿瘤细胞的侵袭和迁移提供了条件[13]。MMPs是一类重要的基质降解酶，含有多个成员，在肿瘤转移过程中发挥促进作用[14]。MMP-2和MMP-9是MMPs成员，也是目前发现的与肿瘤转移能力关系最为密切的正调控因子[15]。本实验结果显示，下调SNHG1表达后，神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖、侵袭和迁移能力均下降，同时细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平下降，提示下调SNHG1可能是抑制神经母细胞瘤恶性生长和转移的有效方法。

LncRNA具有多种生物学作用，其作用机制与靶向调控基因的表达有关，并且同一个lncRNA在不同的病理、生理过程中可能靶向调控不同的基因[16-17]。本实验结果证实SNHG1可以靶向负调控SK-N-SH细胞中miR-145的表达。miR-145在肿瘤组织中表达异常下调，在肿瘤进展中发挥类似抑癌基因的作用，上调miR-145表达可以抑制神经母细胞瘤、肺癌等肿瘤细胞的生长和侵袭[18-19]。本实验结果显示，阻断miR-145表达可以逆转下调SNHG1对SK-N-SH细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用，SNHG1促进神经母细胞瘤恶性生长和转移的作用机制可能与降低miR-145的表达有关

综上所述，SNHG1在神经母细胞瘤发生和转移中可能发挥促进作用，下调SNHG1可以降低神经细胞瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，靶向抑制SNHG1可能是神经母细胞瘤治疗的途径。本实验结果为研究SNHG1在恶性肿瘤中的作用和机制提供了参考，为研究神经母细胞瘤分子发生机制提供了资料。