低弹性模量医用钛合金梯度复合材料对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响

李 楠,吴文慧,许 莹,魏子琰

1)华北理工大学口腔医学院 河北唐山 063000 2)华北理工大学材料与工程学院 河北唐山 063000

钛合金具有密度小、比强度高、生物及力学相容性较好及易加工成型等特点，已发展成为一类量大面广的中高端外科植入物的主要原材料[1]。生物医用钛合金在应用过程中主要经历了三次变革，各方面性能逐步优化，但是临床上常因其弹性模量与骨不匹配产生应力屏蔽效应以及生物相容性差，导致植入失败。因此研究如何降低钛合金弹性模量，提高生物相容性具有重要的临床意义。大量研究[2-4]表明，多孔钛合金的弹性模量更接近人骨，其孔隙结构有利于骨组织的长入。钽作为整形外科应用的生物材料，在临床实践中获得了相当大的关注。它具有优异的化学稳定性和生物相容性，并且比钛或钴-铬合金更具骨传导性[5]。作者为提高钛合金在口腔外科植入手术的成功率，设计制备了以多孔钛合金为基底，表面喷涂钽活性涂层的新型医用钛合金梯度复合材料，并应用MTT法评价低弹性模量医用钛合金梯度复合材料的细胞毒性，为其应用于临床提供生物学依据。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂L929小鼠成纤维细胞(华北理工大学口腔医学院实验室提供)。纯氢化钛粉、纯锆粉、纯铌粉、纯钼粉、纯钽粉、无水乙醇、硬质酸钠、RPMI 1640(美国Corning公司)，PBS和胰蛋白酶(以色列BI公司)，胎牛血清(德国Cegrogen公司)，MTT和DMSO(日本TCI公司)，酶标仪SM600(上海永创医疗器械有限公司)，倒置相差显微镜Primovert(德国ZEISS公司)，场发射扫描电子显微镜S-4800(日本Hitach公司)。

1.2试件制备利用合金团簇模型理论设计合金成分。采用粉末冶金法在1 400 ℃烧结2 h制备出Ti-27Nb-6Zr-5Mo合金(钛合金试件)；采用阳极氧化法在钛合金表面原位构建纳米氧化层(氧化层试件)；在构建氧化层的基础上采用等离子喷涂法在钛合金表面制备钽涂层，形成以钛合金为基底，纳米氧化层为过渡层，表面覆盖钽活性涂层的新型医用钛合金梯度复合材料(钽涂层试件)。试件均制备成直径10 mm、厚2 mm的圆柱体(由华北理工大学材料与工程学院实验室提供)，置于扫描电镜下观察表面形态。

1.3试件浸提液制备每组取8个试件，用无水乙醇浸泡30 min，超声波清洗器清洗15 min，去离子水冲洗，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。经过以上处理的试件置于24孔板中，以含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基为浸提介质，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中浸提72 h，试件表面积与培养基体积比为1.25 cm2∶1 mL[6]。浸提液经 0.22 μm 滤膜过滤除菌备用。

1.4MTT检测细胞增殖取对数生长期L929细胞，按每孔2 000个接种于96孔板中，分为5组，每组4孔，每孔加100 μL细胞悬液培养24 h。待细胞贴壁后，钛合金组、氧化层组和钽涂层组用相应试件浸提液置换旧培养基，阴性对照组用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基置换，阳性对照组用体积分数0.6%的苯酚溶液置换。将细胞置37 ℃、体积分数5%CO2孵箱中培养，第1、3、5天取出，倒置相差显微镜下观察细胞形态。每孔加20 μL MTT(5 g/L)，继续培养4 h后弃旧培养基，每孔加150 μL DMSO。室温下振荡15 min，调节酶标仪设置波长为490 nm，检测吸光度(A)值。实验重复3次。

1.5毒性分析细胞相对增殖率(RGR) = (实验组A值均值/阴性对照组A值均值)×100%。根据RGR分5级：>99%为0级；75%～为1级；50%～为 2 级； 25%～为3级；1%～为4级；<1%为5级。0级或1级表示材料毒性低；2级则应结合细胞形态进行综合毒性分析；3～5级表示材料毒性大。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，同一时间点各组间和各组不同时间点A值比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.13种试件扫描电镜结果见图1。

A：钛合金组(×500)；B：氧化层组(×1 000)；C：钽涂层组(×5 000)

2.2各组细胞增殖情况第1、3、5天，钛合金组、氧化层组和钽涂层组细胞形态正常，呈多角形，核质清晰，数目逐渐增多；阴性对照组细胞形态良好，呈多角形，核质清晰，数目逐渐增多；阳性对照组细胞数目减少，细胞形态不规则，可见细胞碎片，未见明显细胞核(图2)。各组细胞A值比较见表1。

A:钛合金组；B：氧化层组；C：钽涂层组；D：阴性对照组；E：阳性对照组；1～3：分别为第1、3、5天

表1 各组细胞A值 (n=3)

2.3毒性分析结果钛合金、氧化层和钽涂层第1天毒级均为1级，第3、5天均为0级；阴性对照毒级均为0级；阳性对照第1天毒级为2级，第3天为3级，第5天为4级(表2)。

表2 各组细胞的RGR %

3 讨论

植入材料主要用于恢复骨组织缺损和修复破碎的骨组织，由于这些材料与周围组织的密切接触，因此它们应该无毒且具有良好的生物相容性。细胞培养技术被广泛用于评价医用材料的生物相容性。本研究应用MTT法测定低弹性模量医用钛合金梯度复合材料对L929细胞增殖的影响，并分析其细胞毒性。多项研究[7]结果证实MTT法是一种安全、简便、快速、可靠的细胞活性定量方法。该方法用于体外生物相容性评价，因为它提供了有关细胞活力的信息。

近年来复合材料逐渐得到广泛的关注，为了弥补单种材料的不足，将两种甚至多种材料结合起来，可使其优点最大化。很多人体组织具有复杂奇特的结构，例如骨组织，其内部为松质骨，疏松多孔弹性大，而外部为密质骨，致密坚硬耐压性强，表层附以坚韧的骨膜为其提供营养物质。为模仿天然组织结构，各种双相[8-10]、多相[11-13]和梯度[14-16]复合材料已被开发。实际上骨组织可被认为是一种梯度组织，我们设计的这个仿生梯度复合材料，用钛、铌、锆、钼无毒元素烧结出近β型的低弹性模量多孔钛合金，在其表面等离子喷涂高生物活性金属钽。为加强两种金属的结合力，在多孔钛合金表面原位构建纳米氧化层，这样的结构不仅可以使钽涂层更牢固，也可以结合更多的钽金属。这种低弹性模量医用钛合金梯度复合材料改善了传统钛合金弹性模量与骨不匹配、含潜在有毒元素、低生物活性等缺点。

本实验采用MTT法检测低弹性模量医用钛合金梯度复合材料对小鼠成纤维细胞L929形态及增殖率的影响，结果表明，钛合金、氧化层和钽涂层组细胞形态良好，呈多角形，胞核清晰，胞质均匀，随着培养时间的延长，细胞数量增长迅速；细胞毒性检测第1天3种材料均为1级，第3、5天均为0级，说明低弹性模量医用钛合金梯度复合材料生物安全性良好，无短期细胞毒性。Xu等[17]研究表明，无论孔隙率百分比如何，多孔设计有利于细胞向内生长、营养供应和细胞废物排出，所有多孔Ti-25Nb合金都显示出良好的生物相容性。于晓明等[18]研究表明，钽涂层可以沉积在多孔基体的外表面及内表面，细胞黏附实验表明钽涂层表面的细胞融合情况良好，细胞分泌基质情况均优于钛合金。国外学者[19]用细胞黏附剂RGD肽功能化钽表面，增强了成骨细胞样细胞的附着和扩散。钛合金、氧化层和钽涂层组的细胞增殖率均随着培养时间的延长而增加，第3、5天的细胞增殖率较第1天明显提高，并高于阴性对照组，说明构建纳米氧化层与钽涂层均可以促进细胞增殖。

本实验研究结果初步表明低弹性模量医用钛合金梯度复合材料在短期内无细胞毒性，应继续进行更为全面的生物学实验研究。