紫檀芪对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

王 腾，孙华磊，葛惠娜，刘欣欣，李 星，李文杰

郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

肥胖是一种复杂的多因素疾病，它是由脂肪过度堆积所引起，而随着经济发展和生活方式的改变，全球肥胖和超重人口已经从1980年的8.6亿上涨至2013年的21亿[1]，国内情况也不容乐观[2]。目前所使用的治疗肥胖的药物，都存在一定的不良反应[3]。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是一种天然多酚化合物，主要存在于蓝莓、葡萄等浆果中，具有抗炎、抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖和转移等多种功能，有研究[4]证实PTE能够抑制前脂肪细胞增殖和脂质的堆积，从而减少脂肪组织，但PTE干预是否能够影响前脂肪细胞分化尚未明确。因此，本研究通过建立3T3-L1前脂肪细胞分化模型，在细胞分化过程中进行PTE干预，探讨PTE对前脂肪细胞分化的影响以及可能的机制。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器PTE(纯度98%，上海士锋生物科技有限公司)，DMEM培养液(美国HyClone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，羧甲基纤维素钠、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰岛素、油红O(北京索莱宝生物科技有限公司)，全细胞蛋白提取裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(北京鼎国昌盛生物科技有限公司)，葡萄糖检测试剂盒、游离脂肪酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，β-actin、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)α多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，恒温CO2培养箱(日本SANYO公司)，超净工作台(山东博科生物产业有限公司)，酶标仪(美国BioTek公司)，蛋白凝胶成像仪(美国通用电气仪器公司)。

1.2培养基配制基础培养基：量取DMEM培养液90 mL、胎牛血清10 mL于容量瓶中，加入1 mL青链霉素混合液(含青霉素10 kU/mL、链霉素10 g/L)，混匀后用0.22 μm微孔过滤器过滤，4 ℃储存待用。

诱导培养基A：准确量取2 mmol/L地塞米松贮存液50 μL、2 g/L胰岛素贮存液0.5 mL、50 mmol/L IBMX贮存液1 mL，溶入98.5 mL基础培养基中，混匀。现用现配。

诱导培养基B：准确量取2 g/L胰岛素贮存液0.5 mL，溶入99.5 mL基础培养基中，混匀。现用现配。

1.3细胞分化及干预3T3-L1前脂肪细胞购自中科院上海细胞库。①细胞分化：待细胞在基础培养基中生长至90%～100%融合时，更换新的培养基，继续培养。48 h后更换为诱导培养基A，继续培养48 h后更换为诱导培养基B，48 h后更换为基础培养基，后每2 d更换1次基础培养基，10～12 d后3T3-L1前脂肪细胞即可分化为成熟脂肪细胞。②干预：实验设置PTE低(15 μmol/L)、中(30 μmol/L)、高(60 μmol/L)剂量组[4-5]和对照组。细胞分化过程中，在更换诱导培养基A的同时，干预组分别加入相应浓度的PTE溶液，对照组加入等体积溶剂羧甲基纤维素钠，48 h后停止干预，并按照诱导细胞分化步骤继续诱导细胞分化。

1.4细胞分化程度和脂质堆积测定诱导细胞分化成熟后，吸弃培养基，加入100 g/L多聚甲醛固定细胞20 min，加入适量新配制的油红O染液室温染色20 min，洗去背景色，显微镜下观察细胞染色情况。然后使用异丙醇洗去油红O染液，收集洗脱染液的异丙醇，使用酶标仪在510 nm处测量光密度(OD)值，以此间接反映细胞的分化程度。每组设6个复孔，实验重复3次。

1.5细胞糖消耗量测定细胞诱导分化后，吸弃旧的培养基，用新的基础培养基继续培养。24 h后收集各组细胞的培养基，使用葡萄糖检测试剂盒采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定其中葡萄糖含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。后用无细胞培养基中葡萄糖含量减去所测的葡萄糖含量，即为细胞的糖消耗量。每组设6个复孔，实验重复3次。

1.6游离脂肪酸生成量测定细胞诱导分化后，更换新的基础培养基继续培养。24 h后收集各组细胞的培养基，使用游离脂肪酸测定试剂盒测定其中游离脂肪酸含量，测量过程严格按照试剂盒说明书进行。每组设6个复孔，实验重复3次。

1.7细胞中PPARγ、C/EBPα蛋白表达的Western blot测定诱导细胞分化成功后，细胞裂解液处理细胞3～5 min，提取细胞蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，调整上样蛋白量，并加入上样缓冲液。60 V电压电泳30 min，然后120 V电泳至溴酚蓝指示剂距分离胶底部 1 cm，300 mA恒流2 h转移蛋白印迹至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉液封闭90 min，加入一抗(PPARγ 抗体1∶3 000、C/EBPα 抗体1∶1 000稀释)，4 ℃封闭过夜。洗涤后，与二抗室温摇床孵育2 h，ECL显色。使用Alpha软件进行灰度值分析，以β-actin(1∶3 000稀释)为内参，目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 21.0对数据进行统计分析。不同组间油红O染色OD值、糖消耗量、游离脂肪酸以及PPARγ、C/EBPα蛋白相对表达量的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1PTE对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响结果见图1、表1。镜下可见未分化的3T3-L1前脂肪细胞呈梭形，分化后的成熟脂肪细胞则变为圆形或者近似圆形，且胞质内有脂滴聚集，经油红O染色可以观察到成熟脂肪细胞内的脂滴被染色。

A：前脂肪细胞(×100)；B：诱导分化12 d后的脂肪细胞(×200)；C：油红O染色的脂肪细胞，箭头所示为脂滴堆积(×200)

2.2各组细胞糖脂代谢的比较结果见表1。与对照组相比，各PTE剂量组细胞糖消耗量升高；高剂量组细胞的糖消耗量高于PTE低和中剂量组。与对照组相比，各PTE剂量组细胞游离脂肪酸生成量均降低，并且PTE高剂量组低于低和中剂量组。

2.3各组细胞中PPARγ和C/EBPα蛋白表达的比较结果见图2、表2。除PTE低剂量组C/EBPα外，与对照组相比，各PTE剂量组的PPARγ和C/EBPα蛋白表达水平均下降，并且PTE高剂量组降低最明显。

1：对照组；2：PTE低剂量组；3：PTE中剂量组；4：PTE高剂量组

表2 各组细胞中PPARγ、C/EBPα蛋白相对表达量的比较(n=3)

3 讨论

正常脂肪细胞分化过程为多功能干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→成熟脂肪细胞[6]，前脂肪细胞储存在人体各个脂肪库中，能够吸收、聚集脂质，从而分化为成熟脂肪细胞，成熟脂肪细胞中脂质的过度堆积会导致肥胖。有研究[7]证实前脂肪细胞的过度分化与肥胖的发生、发展密切相关，因此抑制前脂肪细胞分化可能会成为肥胖控制和治疗的有效手段。本研究通过“经典鸡尾酒法”诱导3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化[8]，并在细胞分化的过程中进行PTE干预，探讨PTE对前脂肪细胞分化的影响。

前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞后，有两个主要的特征：一是细胞形态的变化，由梭形转变为圆形或椭圆形；二是成熟脂肪细胞开始合成甘油三酯，以脂滴的形式储存在胞质内，并且脂滴的数量和大小能够间接反映脂肪细胞的分化程度[9]。本研究通过鸡尾酒法诱导细胞分化后，细胞形态变化符合以上描述，表明诱导细胞分化成功。油红O染液可对成熟脂肪细胞中的甘油三酯进行特异性染色，OD值检测结果提示PTE干预能够减少脂肪细胞分化过程中脂质的堆积，从而间接表明PTE干预能够抑制前脂肪细胞分化。

肥胖会引起机体糖脂代谢紊乱，而糖、脂毒性往往相互影响，相互促进，形成恶性循环。脂代谢异常会抑制细胞中糖原的合成，促进糖异生，引起脂肪氧化缺陷，过量游离脂肪酸会抑制胰岛素的分泌，导致糖代谢紊乱；同时长期的糖脂代谢紊乱会刺激脂肪细胞释放多种炎性因子，妨碍胰岛信号的传导，进而加重了脂肪细胞对葡萄糖的转运和利用障碍[10]。本研究结果显示，PTE干预能提高脂肪细胞的糖消耗能力，同时减少游离脂肪酸的生成，提示PTE能够改善脂肪细胞的糖脂代谢。

前脂肪细胞分化需要多种核转录因子的参与，其中C/EBP家族和PPAR家族是目前公认最重要的转录因子[11]。PPARγ是PPAR家族中最具有脂肪细胞专一性的成员，主要在脂肪细胞中表达，PPARγ在前脂肪细胞诱导分化的第2天开始转录，目前已有研究[12]证实PPARγ能够调控前脂肪细胞分化，并且PPARγ基因敲除的前脂肪细胞会丧失分化能力；C/EBPα在前脂肪细胞分化过程中与PPARγ具有协同作用[13]，C/EBPα在诱导分化的第2天开始表达，但C/EBPα的表达较PPARγ晚，能使前脂肪细胞进入分化的终末阶段，诱导细胞中脂滴的形成[14-15]。本研究结果提示，在一定浓度范围内，PTE干预能够抑制前脂肪细胞分化过程中PPARγ和C/EBPα蛋白的表达，表明PTE能够抑制前脂肪细胞的分化。

综上所述，PTE能够抑制3T3-L1前脂肪细胞分化，减少分化过程中的脂质堆积，并改善脂肪细胞的糖脂代谢，其机制可能与抑制PPARγ和C/EBPα蛋白表达有关。该研究结果为肥胖的控制和预防提供了新的思路和理论依据。