不同品种黄皮果汁的品质及抗氧化能力

彭 程， 薛海军， 常晓晓， 邱继水， 陈 喆， 林志雄， 陆育生*

(1． 广东省农业科学院果树研究所∥农业部南亚热带果树生物学及遗传资源利用重点实验室∥广东省热带亚热带果树研究重点实验室， 广州 510640； 2． 韶关市武江区生产力促进中心， 韶关 512026)

黄皮(Clausenalansium)为岭南特色果树，原产中国，主要分布在广东、广西、福建和海南等地[1]，品种资源十分丰富. 黄皮果实外观诱人、风味独特、营养丰富，且具有生津止渴、健胃消食、止咳化痰、行气止痛等功效[2]；此外，黄皮果实富含的多酚类等生物活性物质还具有抗氧化[3]、抑肿瘤[4]、预防老年痴呆[5]等作用，是稀有的食药兼用型水果，深受广大消费者的喜爱. 当前我国商业栽培的黄皮产期主要集中在7月中旬至8月上旬，产期短，收获集中；黄皮为典型的高呼吸代谢水果，采后品质劣变迅速，2～3 d便失去商品价值[6]；随着面积和产量的不断增加，销售压力也日趋严峻，个别地区甚至开始出现供大于求、果贱伤农的事件. 因此，为稳定鲜果市场价格，增加果农的经济收入，除了靠产期调节和采后贮运保鲜技术外，开展黄皮深加工利用极为必要. 开发附加值高的果汁产品是水果产业加工领域的主要方向[7]，品质评价对果汁产品的研发、储运和流通具有重要的指导意义，彭程等[8]曾对黄皮果汁的有机酸组分和含量进行系统分析，发现柠檬酸是黄皮果汁有机酸的主要组分，且不同品种含量差异较大，然而目前尚未见有关黄皮果汁品质综合分析的报道. 在产品开发方面虽然有少数的报道[9-11]，但均集中在生产工艺方面，且仅限于研究阶段，尚未见成熟的产品面世. 本研究选取了覆盖我国所有栽培类型的20个黄皮代表性品种，测定分析其果汁的基础品质、主要抗氧化功能活性成分含量以及抗氧化能力，比较了不同品种间的差异性，以期为进一步研究和开发黄皮果汁功能性产品提供理论依据，同时也为黄皮加工适用型品种的筛选提供借鉴.

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：黄皮果实均采自广东省农业科学院果树研究所农业部广州黄皮种质资源圃，供试的品种共20个，分别是从甜1号、冰糖、番禺1号、白云1号、凤梢5号、白糖、崛督4号、老屋2号、揭阳无核、广杂3号、细鸡心、水西鸡心、江门2号、果选1号、金鸡心、龙门5号、后园1号、郁南无核、金丰、潮州2号.

试剂：蔗糖、抗坏血酸、二硫苏糖醇、没食子酸、儿茶素、福林-酚试剂(Folin-Ciocalteu试剂)、水溶性维生素 E(Trolox)、2，4，6-三(2-吡啶基)-1，3，5-三嗪(TPTZ)及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等购自美国 Sigma-Aldrich 公司；其他试剂均为国产分析纯.

仪器：不锈钢手动榨汁机购自苏州嘉力仕机械设备有限公司；XB323电子分析天平购自上海精科天美科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅购自常州国华电器有限公司；Sartorius酸度计购自赛多利斯仪器有限公司；PAL-1数显手持便携式折光仪购自日本爱宕公司；SP-722型可见分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；Centrifuge 5810R离心机购自艾本德中国有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 黄皮果汁的制备 在果实成熟时采集上述不同品种的黄皮果实置于冰上立即送往实验室，剔除腐烂、机械损伤和病虫危害等残次果后充分清洗，去核，手工榨汁，汁液通过孔径0.15 mm(100目)双层滤布过滤，滤液于4 ℃、10 000 r/min条件下离心15 min后，取上清果汁样品于-80 ℃冷冻保存备用.

1.2.2 果汁基础品质指标的测定 pH值采用Sartorius酸度计直接测定；可溶性固形物的质量分数采用数显手持便携式折光仪Pocket PAL-1测定；可溶性糖的质量分数采用蒽酮比色法测定[12]；总酸质量分数采用酸碱滴定法[13]，以柠檬酸计；糖酸比用可溶性糖质量分数和可滴定酸质量分数的比值表示.

1.2.3 抗坏血酸质量浓度的测定 参考KAMPFENKEL等[14]的方法，略作修改. 原果汁稀释一定倍数后取150L，分别加入300L磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.4)、150L 10 mmol/L二硫苏糖醇，充分混匀后于42 ℃水浴中反应15 min，然后加入150L 0.5%的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，静置1 min后再分别加入750L 10%三氯乙酸溶液、600L 42%H3P04溶液、600L 4%联吡啶溶液和300L 3% FeCl3(现配现用)，混匀后立即震荡，42 ℃水浴中反应40 min，于波长525 nm处测定吸光值，以6%三氯乙酸溶液代替样品作空白对照. 以抗坏血酸为标准品，绘制标准曲线，以每升果汁中含有的抗坏血酸毫克数计,表示为mg/L.

1.2.4 总黄酮质量浓度的测定 参考JIA等[15]的方法，略作修改. 原果汁稀释一定倍数后取300L，加入1.2 mL H2O和120L 5%的NaNO2溶液，反应5 min后加入90L 10% AlCl3·6H20溶液，6 min后加入600L 1mol/L的NaOH溶液，加蒸馏水补足总体积为3 mL，于510 nm处测定吸光值, 以70%的甲醇溶液代替样品作空白对照. 以儿茶素(Catechin)为标准物质绘制标准曲线，最终结果以每升果汁中含有的儿茶素当量(Catechin Equivalent, CE)表示，单位为mg/L.

1.2.5 总酚质量浓度的测定 参考KIM等[16]的方法，略作修改. 原果汁稀释一定倍数后取300L，加入360L H2O，再加240L Folin-Ciocatieu试剂，充分摇匀后，室温静置6 min，随后加入1.2 mL 7% Na2CO3溶液，加蒸馏水补足总体积为3 mL，暗室反应 60 min后，于760 nm处测定吸光值，以70%的甲醇溶液代替样品作空白. 以没食子酸(Gallic Acid)为标准物质绘制标准曲线，最终结果以每升果汁中含有的没食子酸当量(Gallic Acid Equivalent，GAE)表示，单位为mg/L.

1.2.6 抗氧化活性的测定

(1) DPPH自由基清除能力测定. 参考BRAND-WILLIAMS等[17]的方法，略作修改. 原果汁稀释一定倍数后，取300L，加入2.7 mL 80mol/L的DPPH甲醇溶液，充分混匀后，置于暗室反应30 min，于517 nm波长下测定其吸光值，以70%的甲醇溶液代替样品作空白，按照文献所述公式计算样品对DPPH的清除率. 以Trolox为标准物质，配制系列质量浓度梯度标准溶液，用同样方法测定并计算其对DPPH的清除率. 以Trolox质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标，绘制标准曲线. 最终结果以每升果汁所含的Trolox当量(Trolox Equivalent，TE)表示，单位为mg/L.

(2)铁离子还原抗氧化力(Ferric Reducing Antioxidant Power，FRAP)测定. 参考BENZIE与STRAIN[18]方法，略作修改. 原果汁稀释一定倍数后取300L，加入FRAP工作液2.7 mL(300 mmol/L pH 3.6醋酸盐缓冲液25 mL、10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL、20 mmol/L FeC13·6H2O溶液2.5 mL，现配现用)，充分混匀后，37 ℃水浴锅中避光反应40 min，于593 nm波长下测定其吸光值，以70%的甲醇溶液代替样品作空白. 以Trolox为标准物质，绘制标准曲线. 最终结果以每升新鲜果汁中含有Trolox当量(Trolox Equivalent，TE)表示，单位为mg/L.

1.2.7 统计分析 每个样品测定重复3次，结果以平均值±标准差表示，所有数据用Excel 2007进行处理，用SPSS 16.0统计软件进行差异显著性分析及聚类分析.

2 结果与分析

2.1 不同品种黄皮果汁基础品质的比较

对供测样品的pH、可溶性固形物的质量分数(w(可溶性固形物))、可溶性糖的质量分数(w(可溶性糖))、可滴定酸的质量分数(w(可滴定酸))及糖酸比等基础品质指标进行分析，结果见表1. 不同黄皮品种果汁的基础品质存在明显差异. 20个品种黄皮的pH变化范围为3.40～5.95，其中番禺1号最高，达5.95，其次是白云1号，后园1号的pH最低，仅为3.40. 可溶性固形物是评价果实品质的综合指标，包含糖、酸、维生素和矿物质等多种成分[19]. 不同品种黄皮果汁的w(可溶性固形物)在14.27%～21.67%之间，其中w(可溶性固形物)大于20%的品种有崛督4号、老屋2号、揭阳无核、水西鸡心和广杂3号，均显著高于其他品种，而江门2号的w(可溶性固形物)最低. 果实中的糖、酸质量分数及其配比是决定果实风味品质最重要的指标[20]，高酸低糖的果实口感过酸，而高糖低酸则会使果实风味变淡. 就w(可溶性糖)而言，后园1号和果选1号的w(可溶性糖)较低，而揭阳无核和水西鸡心的w(可溶性糖)较高. 后园1号、龙门5号和江门2号的w(可滴定酸)较高，而凤梢5号的w(可滴定酸)最低. 凤梢5号果汁的糖酸比最高，达299.94，而后园1号的糖酸比最低，仅有5.25. 综合上述指标，揭阳无核和老屋2号果汁的w(可溶性固形物)最高，糖酸比适中，风味最好.

2.2 不同品种黄皮果汁的抗氧化物质质量浓度及抗氧化活性比较

抗坏血酸、总黄酮和总多酚是植物中重要的生物活性物质，具有较强的抗氧化能力[21]. 从表2可知：不同品种黄皮果汁的3种抗氧化物质质量浓度也存在明显差异. 各品种黄皮的ρ(抗坏血酸)在391.4～2 276.4 mg/L之间，老屋2号、崛督4号、揭阳无核和水西鸡心的ρ(抗坏血酸)较高，均高于2 000.0 mg/L，细鸡心和广杂3号的次之，冰糖的最低，低于400.0 mg/L. 各品种黄皮的ρ(总黄酮)在11.6～479.1 mg/L，老屋2号和揭阳无核的较高，其次是广杂3号和崛督4号，从甜1号、白糖和凤梢5号的较低，均低于20.0 mg/L. 20个品种黄皮的ρ(总多酚)在551.1～4 673.3 mg/L 之间，ρ(总多酚)最高的品种是揭阳无核，老屋2号次之，番禺1号的最低.

目前，检测水果抗氧化能力的方法有很多，常见的有DPPH法[17]、羟基自由基清除(Hydroxyl Radical Scavenging，HRSA)法[22]、氧自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Aapacity,ORAC)法[23]和FRAP法[18]等. 由于不同的方法测定机理有所差异，还没有单独一种方法能够精确地评价果实的抗氧化活性[24-25]，因此需要采用多种方法进行综合评价. 本研究分别采用DPPH和FRAP法来评价黄皮果汁的抗氧化活性，结果表明：2种测定方法均表现出不同品种之间的抗氧化能力存在明显差异，且不同测定方法的评价结果也不尽相同(表2). 不同品种的DPPH自由基清除能力变化范围为163.8～1 243.8 mg/L，揭阳无核最高，其次是细鸡心和崛督4号，凤梢5号最低. 不同品种的FRAP抗氧化能力在86.8～1 523.6 mg/L 之间，FRAP抗氧化能力较高的品种有揭阳无核、老屋2号、崛督4号、细鸡心、广杂3号，白糖的FRAP抗氧化能力最弱.

表1 不同品种黄皮果汁的基础品质Table 1 The basic qualities of fruit juice in different wampee cultivars

注：数据为3次重复的平均值和标准差,同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，表3同.

表2 不同品种黄皮果汁的抗氧化物质质量浓度及抗氧化活性Table 2 The antioxidant contents and antioxidant activities of fruit juice in different wampee cultivars

2.3 聚类分析

利用SPSS16.0对20个黄皮品种的上述10项理化指标进行聚类分析，结果如图1所示，在欧氏距离6.0处可将20个黄皮品种分成3组. 第Ⅰ组包括从甜1号、白糖、冰糖、白云1号、凤梢5号和番禺1号，这6个品种的w(可溶性糖)中等，w(可滴定酸)最低，糖酸比最高，抗氧化物质质量浓度低，抗氧化能力最差，风味清甜，无酸感. 第Ⅱ组包括果选1号、后园1号、潮州2号、龙门5号、郁南无核、金鸡心和江门2号，这7个品种的w(可溶性糖)最低，w(可滴定酸)最高，糖酸比最低，风味偏酸，抗氧化物质的质量浓度和抗氧化能力处中等水平. 第Ⅲ组包括老屋2号、揭阳无核、崛督4号、水西鸡心、广杂3号、细鸡心和金丰，这7个品种在所有品种中的w(可溶性固形物)和w(可溶性糖)最高，ω(可滴定酸)和糖酸比中等，风味酸甜可口，抗氧化物质的质量浓度高，抗氧化能力最强. 可见，通过聚类分析可以将指标水平相近的品种聚在一起，有利于对不同目标的筛选.

图1 基于理化指标的黄皮品种聚类分析的树状图Figure 1 The cluster analysis dendrogram of different wampee cultivars based on physic-chemical indices

2.4 黄皮果汁中抗氧化物质质量浓度与抗氧化活性的相关性分析

不同种类的抗氧化物质对不同类型水果抗氧化活性的贡献有所不同，丁秀玲等[12]的研究发现苹果中的总酚含量与抗氧化活性之间呈显著正相关，而抗坏血酸对苹果的抗氧化作用没有显著贡献. 赵金梅等[19]和DU等[26]在研究不同品种猕猴桃的抗氧化活性时发现：总多酚和抗坏血酸对猕猴桃果实的抗氧化作用均具有显著贡献. 罗亚等[27]在对草莓果实抗氧化能力及其抗氧化活性成分进行分析时亦发现：总多酚和抗坏血酸与抗氧化能力显著相关，而类黄酮对抗氧化作用的贡献很小. 吴慧等[28]对越橘果实的研究结果则表明：总多酚和类黄酮是越橘抗氧化作用的主导成分. 本文研究了黄皮果实中不同抗氧化物质对抗氧化活性的贡献(表3)，结果表明：ρ(抗坏血酸)、ρ(总黄酮)和ρ(总多酚)均与DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力成极显著正相关(P<0.01)，表明抗坏血酸、总黄酮和总多酚在黄皮抗氧化能力方面均发挥重要作用，其中以总多酚和抗坏血酸的作用尤为突出. 从表3还可以看出，DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力呈极显著正相关，这与在番石榴[29]、枇杷[30]和草莓[27]等多种水果中的研究结果相一致，说明DPPH法和FRAP法用于评价黄皮抗氧化能力是可行的.

表3 黄皮果汁的抗坏血酸、总黄酮、总多酚的质量浓度与抗氧化活性的相关性分析Table 3 The correlation analysis of the antioxidant activities and the contents of ascorbate, total flavonoids and total phenolics in wampee fruit juice

注：**表示差异具有统计学意义(P<0.01)

3 结论

不同品种黄皮果汁的基础品质、抗氧化功能成分以及抗氧化活性存在明显的差异，表明基因型是决定其品质和抗氧化能力的重要因素. 基于10项理化指标的聚类分析可将20个黄皮品种分为3大类群：第Ⅰ组糖酸比最高，风味清甜，ρ(抗氧化物质)和抗氧化活性最低；第Ⅱ组的w(可滴定酸)最高，风味偏酸；第Ⅲ组的w(可溶性固形物)、ρ(抗氧化物质)和抗氧化活性均最高，风味品质和营养价值最好. 可见，通过聚类有利于对不同目标的筛选. DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力均与ρ(抗坏血酸)、ρ(总黄酮)和ρ(总多酚)呈极显著正相关，表明抗坏血酸、总黄酮和总多酚是黄皮果汁抗氧化作用的重要物质基础. 20个品种中揭阳无核的w(可溶性固形物)最高，糖酸比适中，ρ(总多酚)、DPPH自由基清除能力以及FRAP抗氧化能力最强，可为黄皮果汁功能性产品的开发提供材料.