非甾体类抗炎药对人牙髓细胞的抗炎修复作用

李婧宜，王赛楠，董艳梅

(北京大学口腔医学院·口腔医院，牙体牙髓科 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室， 北京 100081)

保存活髓是牙髓病首选的治疗方法和重要研究方向[1]。牙髓牙本质复合体作为牙齿特有的结构，具有防御机能，轻度而温和的炎症反应会启动牙髓的自我修复[2]，严重的炎症反应会造成不可逆的牙髓损伤，导致牙髓坏死。在牙髓炎症反应过程中，炎症因子的种类和表达量影响炎症的进展和转归[3]。白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介导细胞免疫特别是巨噬细胞的吞噬活动[4-5]，其大量表达提示牙髓的不可逆性炎症[6]；而IL-10、IL-4等因子的上调对于炎症能起到抑制作用，可促进牙髓组织的修复[7]。使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激牙髓可以模拟牙髓炎症反应，低浓度的LPS能够显著上调牙髓细胞炎症相关基因IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达[8-11]。使用LPS诱导动物牙髓组织炎症，组织病理学切片可观察到牙髓组织不同程度的炎症反应[12-13]。

非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)可通过抑制环氧酶(cyclooxygenase，COX)-1、COX-2抑制前列腺素的合成和血管舒张，进而达到抗炎镇痛作用[14]。非特异性NSAIDs同时抑制COX-1和COX-2，代表药物有阿司匹林、布洛芬，全身用药时因其抑制正常组织中的COX-1，对胃肠道、心血管等有副作用[15]。特异性NSAIDs仅选择性抑制COX-2，在发挥抗炎镇痛作用的同时，大大降低了胃肠道反应，心血管疾病的风险较低，成为临床上常用抗炎药物[16-17]，代表药物有美洛昔康、双氯芬酸、罗非昔布等。目前NSAIDs对炎症牙髓的研究较少，其作用尚不明确，非特异性和特异性NSAIDs的作用效果是否存在差别尚不清楚。因此，本研究将分别选取非特异性NSAIDs阿司匹林和特异性NSAIDs 美洛昔康，观察二者对牙髓细胞增殖、分化、矿化和炎症因子的影响，目的是研究NSAIDs对炎症牙髓的抗炎和修复作用。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用材料包括：高血糖DMEM培养液(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、Ⅰ型胶原酶、青霉素-链霉素、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、L-谷氨酰胺(Gibco公司，美国)、胎牛血清(fetal bovine se-rum，FBS)(Hyclone公司，美国)。阿司匹林购自北京Solarbio生物公司,美洛昔康购自北京BioRuler公司，LPS(大肠杆菌)购自美国Sigma公司。

1.2 人牙髓细胞的培养

收集无龋、完整的人类第三磨牙(18～25岁)，进行人牙髓细胞(human dental pulp cells，hDPCs)的培养。参照Gronthos等[18]采用的取材方法，将拔除牙齿立即置于DMEM培养液内，3 h内完成牙髓取材和原代细胞培养，实验研究方案通过北京大学口腔医院生物医学伦理委员会审查。

待hDPCs生长融合达80%左右时，PBS溶液轻柔漂洗3次，加入2.5 g/L 胰蛋白酶-EDTA消化液，37 ℃消化30～60 s；在倒置相差显微镜下观察细胞突起收缩、细胞呈亮圆形，加入含有血清的培养液终止消化。收集细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清；加入新鲜DMEM培养液，按照1 ∶3比例接种传代。取4～6代hDPCs用于后续实验。

1.3 MTT检测hDPCs的增殖

分别使用含有不同浓度(1、10、100 μmol/L)的阿司匹林或美洛昔康的培养基培养hDPCs，采用 MTT法检测hDPCs的增殖活性。细胞按密度3×103个/孔等量接种于96孔板中，每组5个复孔，37 ℃、5%(体积分数)CO2细胞孵育箱培养，隔天换液。第 1、3、5、7天，每孔加入180 μL新鲜DMEM培养液、20 μL 5 g/L MTT溶液，培养4 h后，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置 37 ℃摇床上振荡10 min至结晶物充分溶解，酶标仪以波长490 nm测定光密度值(D)。

1.4 Real-time PCR检测hDPCs炎症基因和成牙分化基因的表达

采用real-time PCR法检测炎症基因TNF-α、IL-6和成牙分化基因牙本质基质蛋白(dentin matrix protein-1，DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)表达的情况。将hDPCs分别按密度1×106个/孔、1×105个/孔接种于6孔板中，37 ℃、5%CO2细胞孵育箱中孵育。用含有1 mg/L LPS的培养基培养24 h后获得LPS刺激后的hDPCs(LPS-hDPCs)，用含有不同浓度(1、10、100 μmol/L)NSAIDs(阿司匹林或美洛昔康)的培养基培养LPS-hDPCs，在6 h和7 d用Trizol裂解细胞，提取总RNA。使用Prime Script RT Master Mix反转录试剂盒，各组均用500 ng总RNA在10 μL反应体系中进行反转录合成cDNA。目的基因为TNF-α、IL-6和DMP-1、DSPP，将管家基因GAPDH作为内参，引物序列见表1。Real-time PCR为每管20 μL的扩增反应体系，95 ℃ 3 min预变性同时激活DNA聚合物，95℃变性3 s，60 ℃退火及延伸20 s，共40个循环。每组设置3个复孔，实验重复3次，进行统计学分析。

表1 引物序列表Table 1 PCR primer sequences

DMP-1, dentin matrix protein-1;DSPP, dentin sialophosphoprotein;IL-6, interleukin-6;TNF-α, tumor necrosis factor-α;GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.5 茜素红染色检测矿化结节

矿化诱导液(osteogenic-induced medium，OM)的配制： 2.16 g β-甘油磷酸钠粉末溶于10 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)；100 mg维生素C溶于10 mL PBS；3.92 mg地塞米松粉末溶于1 mL无水乙醇，完全溶解后加入9 mL PBS中。各组分溶液分别使用0.22 μmol/L孔径针头过滤器过滤除菌，分装，-20 ℃保存；使用时每100 mL培养基分别加入1 mL、1 mL和200 μL。

将hDPCs以1×105的密度接种于12孔板中，每组设置3个复孔，至于37 ℃、5% CO2的孵育箱中孵育过夜，待细胞贴壁。待细胞汇合至80%～90%时，分别加入含有1 mg/L LPS和NSAIDs的矿化诱导液，14 d后进行体外矿化检测。吸净待测孔中培养基，PBS冲洗3次，20 g/L 多聚甲醛固定过夜，Milli-Q水冲洗3次，室温下加入等量40 mmol/L pH 4.2的茜素红溶液染色10～20 min，去离子水冲洗去除特异性染色。倒置显微镜下观察、拍照。

将茜素红染色后的孔板彻底晾干，加入1 mL 100 mmol/L氯化十六烷基吡啶溶液，室温下摇床轻摇，彻底溶解孔板底染色。各孔分别吸取150 μL紫色溶液转移至96孔板中。酶标仪内测定562 nm波长下各孔光密度值并进行记录。

1.6 统计学分析

应用SPSS 24.0软件进行统计学分析。采用单因素方差(ANOVA)分析分别对各组细胞的增殖情况、基因表达情况、矿化结节情况进行总体分析，多重比较采用Bonferroni检验，如果数据方差不齐则采用秩和检验(Kruskal-WallisHtest)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSAIDs促进hDPCs增殖

通过MTT法检测1、10、100 μmol/L阿司匹林或美洛昔康培养hDPCs后不同时间点的活细胞数量，结果显示，从第5天起1～100 μmol/L阿司匹林和美洛昔康对细胞增殖均具有显著促进作用，该促进作用具有浓度依赖性，随浓度升高促进作用减弱。经单因素ANOVA分析，差异具有统计学意义(P<0.05，图1)。

2.2 NSAIDs抑制LPS-hDPCs IL-6、TNF-α表达

使用real-time PCR检测LPS-hDPCs炎症基因IL-6、TNF-α表达，结果显示，与对照组相比，LPS组使用LPS刺激牙髓细胞后6 h，IL-6、TNF-α表达量显著升高(图2)；与LPS组相比，阿司匹林1～100 μmol/L和美洛昔康1～100 μmol/L组TNF-α表达量均显著下降，阿司匹林各组间TNF-α表达量差异无统计学意义(P>0.05)，美洛昔康各组间TNF-α表达量差异亦无统计学意义(P>0.05，图2A)，阿司匹林100 μmol/L和美洛昔康1～100 μmol/L组IL-6表达量显著下降(图2B)。与阿司匹林100 μmol/L组相比，美洛昔康100 μmol/L组6 h时IL-6和TNF-α表达量显著下降,经单因素ANOVA分析，差异有统计学意义(P<0.05)。选择美洛昔康100 μmol/L组进行后续分化及矿化实验。

2.3 美洛昔康促进LPS-hDPCs成牙本质向分化

使用real-time PCR检测LPS-hDPCs成牙本质向分化基因DMP-1、DSPP表达，结果显示，美洛昔康组在7 d时DMP-1、DSPP表达量显著高于对照组和LPS组，经单因素ANOVA分析，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

2.4 美洛昔康促进LPS-hDPCs矿化

使用茜素红染色检测LPS-hDPCs矿化，结果显示，2周时阴性对照组镜下无可见红染矿化结节(图4A)， 2周时阳性对照组镜下可见少量散在红染矿化结节(图4B)，LPS组仅可见单个散在红染矿化结节(图4C)，LPS+美洛昔康组可见散在红染矿化结节(图4D)。

通过氯化十六烷基吡啶充分溶解染色的矿化结节后半定量检测所示(图4E)，LPS组钙含量明显低于对照组，LPS+美洛昔康组钙含量显著高于LPS组，经单因素ANOVA分析，差异有统计学意义(P<0.05)，说明LPS会抑制hDPCs的矿化，美洛昔康能够促进LPS-hDPCs的矿化。

3 讨论

抗炎药物的种类和浓度影响其生物安全性。本研究首先对不同浓度阿司匹林或美洛昔康对hDPCs增殖活性进行检测，发现阿司匹林或美洛昔康在1～100 μmol/L的浓度时能够促进细胞增殖，浓度越高促进增殖效果越弱。有研究显示，低浓度阿司匹林对于骨髓间充质细胞具有促增殖作用。当阿司匹林浓度大于5 mmol/L时，会抑制牙髓细胞的增殖[19]。酪洛芬在低浓度时对牙髓细胞增殖无抑制作用[20]。对比几种NSAIDs(美洛昔康、帕瑞昔布、洛诺昔康、双氯芬酸和扑热息痛)对脂肪间充质干细胞的影响发现，低浓度时(10-6μmol/L)对细胞没有抑制作用，且特异性NSIADs(美洛昔康、帕瑞昔布)有促进细胞增殖作用[21]。另外，有学者研究NSAIDs对马骨间充质干细胞的增殖作用，也观察到了药物作用的浓度依赖性[22]。美洛昔康口服剂量为7.5 mg/d和15 mg/d时，血液药物浓度波动范围分别为0.4～1.0 mg/L和0.8～2.0 mg/L(分别为稳态时的最小和最大血药浓度)[17]。本研究选择既往研究中NSAID相对安全且有效的药物浓度，证实1～100 μmol/L的阿司匹林或美洛昔康对hDPCs的增殖具有较好地促进作用。

在炎症过程中，一些炎症因子表达的短时间轻度升高，对细胞分化或组织修复具有一定的促进作用[23]，而反复或高浓度的炎症因子刺激会导致细胞的衰老和凋亡。有研究显示，在感染、创伤以及肿瘤形成过程中，IL-6、TNF-α的表达都有升高，多种细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、纤维细胞和内皮细胞)都可以分泌合成IL-6细胞因子，TNF-α、IL-6随着牙髓组织炎症的加重而表达上升[24-25]。本研究发现，阿司匹林或美洛昔康可以显著下调LPS刺激的hDPCs表达的炎症基因IL-6、TNF-α，且美洛昔康效果更佳。COX-1在正常组织和细胞中就有表达，较少受到调控，而COX-2主要在炎症组织中表达。有研究显示，COX-2主要在牙髓中的炎症部位高表达，相比于其他部位由巨噬细胞表达COX-2，牙髓中的COX-2更多由成纤维细胞表达，而在健康牙髓中极少发现[26-27]。更有研究发现，IL-1β和TNF-α可以有效上调COX-2表达[28-29]，COX-2可能是介导微生物引起牙髓炎症的重要因子[5]。美洛昔康可选择性抑制COX-2，可能是其抑制牙髓炎症效果更佳的原因。

除抗炎作用外，NSAIDs对成牙或成骨修复等方面也有一定的作用。相关研究显示，非特异性NSAID阿司匹林可以有效提高碱性磷酸酶的活性，上调成骨相关基因，促进牙髓干细胞向成骨方向分化。高浓度的阿司匹林(5 mmol/L)通过抑制MARK的p38、JNK信号通路而抑制牙髓干细胞成牙向分化[19]；低浓度的阿司匹林(75 mg/L)可以促进骨髓间充质干细胞成骨向分化[30]。特异性NSAID美洛昔康对小鼠根尖周骨质的形成没有抑制作用[31-32]。Kirschneck等[33]发现，美洛昔康可以有效抑制正畸过程中的牙根外吸收，抑制炎症外吸收中的IL-1、IL-6等基因的表达。将美洛昔康应用于脂肪间充质干细胞时，相比于其他的NSAIDs可以有效促进细胞增殖和碱性磷酸酶活性，增强矿物质形成[22]。本研究显示，100 μmol/L美洛昔康可以促进LPS刺激后的hDPCs的DSPP、DMP-1表达。DSPP是牙本质中主要的非胶原基质蛋白，参与成牙本质矿化的成核过程；DMP-1是一种多功能蛋白，可以通过调控成核过程参与羟基磷灰石的矿化。美洛昔康作为COX抑制剂，可以抑制前列腺素的一个亚型前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的生成，既往研究显示，PGE2对牙髓细胞的作用具有浓度依赖性，高浓度会抑制细胞的分化和矿化[34]。美洛昔康可能是通过调节PGE2的形成，在抑制牙髓细胞炎症反应的同时，促进牙髓细胞的成牙本质向分化和矿化，具体机制还需进一步研究。

综上所述，本研究发现美洛昔康能够促进牙髓细胞增殖，在有效抑制LPS刺激下牙髓细胞炎症因子升高的同时，可促进牙髓细胞的成牙本质向分化和矿化。美洛昔康可能在牙髓炎症中发挥抗炎和促进修复的作用。有关美洛昔康对牙髓损伤修复的作用效果和机制仍需进一步探究。