Zeste同源蛋白2增强子通过调节巨噬细胞趋化影响牙髓炎症反应

陈颖怡，胡紫琪，惠甜倩，刘 鹤

(北京大学口腔医学院·口腔医院，儿童口腔科 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081)

龋病是引发牙髓炎最常见的病因之一。随着龋齿的进展，革兰氏阴性菌的比例增加，产生的病原物质，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，沿牙本质小管进入牙髓，通过多种途径引发牙髓的炎症反应[1-2]。炎症介质的释放及炎症细胞的趋化使牙髓炎症反应进一步加重，但在牙髓炎早期，牙髓尚有自身修复能力，因此，控制牙髓炎发展对活髓保存至关重要[3-4]。

越来越多的研究发现，表观遗传调控在牙髓炎的进展中发挥重要作用[5-6]。表观遗传被定义为在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化[7]。表观遗传的分子机制包括DNA修饰、组蛋白修饰、非编码RNA调控、染色质重塑和核小体定位等[8-9]，其中，组蛋白修饰是表观遗传的形式之一，可通过影响组蛋白与DNA双链的亲和性，改变染色质的疏松和凝集状态，进而影响基因表达[10]。近年来，组蛋白修饰在炎症和修复中的作用逐渐受到关注[6, 11]。

组蛋白H3第27位赖氨酸残基(histone H3 on lysine residues 27，H3K27me)是组蛋白修饰常见的位点。已有研究证实H3K27me3的去甲基化可以促进牙髓的修复反应，zeste同源蛋白2增强子(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)为H3K27me的三甲基化转移酶，为多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的催化亚基，在多种炎症性疾病中发挥着重要作用，如神经系统炎症、肠炎等[12-15]，但EZH2在牙髓炎中的作用机制尚不明确。既往研究表明，EZH2能够促进牙髓炎进展和牙髓细胞增殖，抑制成骨分化；EZH2可以与白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、C-C基序趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)的启动子结合，调节启动子的组蛋白修饰，上调细胞因子表达，其中CCL2的上调最明显[5, 11]。CCL2为单核巨噬细胞的趋化因子，由此推测，EZH2可能通过调节巨噬细胞的趋化进而影响牙髓炎发展。

本研究拟通过检测EZH2在牙髓炎过程中的表达变化，探究EZH2对牙髓炎巨噬细胞趋化的影响。

1 材料与方法

1.1 建立LPS诱导大鼠牙髓炎模型

参照相关研究建立LPS诱导的大鼠牙髓炎模型[16-17]。15只雄性6周龄SD大鼠(维通利华公司，中国)称重后，以7%(质量分数)水合氯醛(源叶公司，中国)腹腔注射(5 μL/g)麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定于实验台上，用1/4涡轮球钻钻磨第一、第二磨牙牙合面至透红，10# 清洁锉刺穿髓角，生理盐水冲洗窝洞，将饱蘸10 g/L LPS(Sigma，美国)的明胶海绵置于穿髓孔处，玻璃离子暂封(3M，美国)。建模后分别于2 h、8 h、1 d、3 d、7 d脱颈处死。收集试验组及对照组颌骨标本，放入4%(质量分数)甲醛溶液固定48 h，经10%(质量分数)乙二胺四乙酸溶液脱钙1个月后，脱水，石蜡包埋。制作5 μm厚度的石蜡切片，HE染色及免疫组织化学染色检测牙髓炎病程的改变。

本研究已获得北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准(批准号：LA2018044)。

1.2 HE染色

将大鼠颌骨组织切片进行二甲苯脱腊，梯度乙醇水化，苏木素染色2 min，流水冲洗2 min，10 g/L盐酸乙醇分色，流水冲洗返蓝5 min，伊红染色30 s，流水冲洗5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察(BX51 Olympus显微成像系统，日本)。

1.3 免疫组织化学染色

将石蜡切片置于58 ℃烤片台上2 h，常规脱蜡，脱水；3%(体积分数)过氧化氢溶液中室温下避光孵育20 min，用0.5%(体积分数)Triton-X 100(Bioruler，美国)透化15 min，放入温度为96 ℃的0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0，中杉金桥公司，中国)中水浴10 min进行抗原修复，冷却至室温；山羊血清室温下封闭30 min；滴加抗EZH2一抗(1 ∶50稀释抗体，Cell Signaling Technology，#5246，美国)，4 ℃孵育过夜；滴加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗(中杉金桥公司)，室温孵育30 min；二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)(中杉金桥公司)显色，光镜下观察。显色完全后，蒸馏水终止；苏木精复染，氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，显微镜下观察。

1.4 免疫荧光双染

一抗孵育前的组织切片处理与免疫组织化学染色一致。使用山羊血清(中杉金桥公司)室温下封闭30 min，用抗EZH2(1 ∶200稀释抗体，Cell Signaling Technology， #5246)和抗CD68抗体(1 ∶200稀释抗体，Abcam，ab31630，英国)4 ℃孵育过夜。使用Alexa Fluor488预吸附的抗兔IgG二抗(1 ∶200稀释抗体，Abcam，ab150117)及Alexa Fluor647预吸附的抗小鼠IgG二抗(1 ∶200稀释抗体，Abcam，ab150083)室温孵育1 h，然后用4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，中杉金桥公司)复染。使用荧光显微镜观察组织切片并拍照。

1.5 细胞培养

收集北京大学口腔医院颌面外科门诊拔除的健康、无龋的第三磨牙以及正畸需要拔除的前磨牙，并提取牙髓组织中的人牙髓细胞(human dental pulp cells，hDPCs)(伦理审批号：PKUSSIRB-201732003)。实验所用细胞为第3～5代。细胞在含有10%(体积分数)胎牛血清(fetal calf serum，FBS，Excell Bio，澳大利亚)α-MEM培养基(Gibco，美国)中培养。人白血病单核细胞系(human leukaemia-derived monocytic cell line，THP-1)细胞(齐氏生物科技公司，中国)在含有10%FBS的RPMI培养基(Gibco)中培养。将THP-1细胞于含有15 μg/L 12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(佛波醇，phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA，Sigma)的培养基中孵育48 h，将THP-1分化成巨噬细胞。镜下确认细胞贴壁、体积增大并呈梭形。

1.6 CCK-8细胞增殖-毒性检测

THP-1细胞及hDPCs在指数生长阶段以5×103/孔接种于96孔板中，24 h后向各孔中加入1、10、20、40、100 μg/L不同浓度的EZH2重组蛋白(Abnova，美国)， 并于孵箱中培养48 h，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液(同仁公司，日本)。孵箱中培养2 h后使用酶标仪(BioTek，ELX808，美国)在450 nm下测量光密度。

1.7 Transwell细胞迁移实验

将hDPCs单层细胞用无血清的含或不含EZH2重组蛋白的α-MEM培养，于2 h提取上清液。将密度为1×106/mL的THP-1巨噬细胞悬液200 μL加入到上室(Corning，美国)。将各组上清液以650 μL/孔加入到下室中，其中含有20%FBS的α-MEM培养基作为阳性对照，不含FBS的α-MEM培养基作为阴性对照。21 h后清除上室未过膜的细胞，4%多聚甲醛溶液固定15 min，结晶紫染色15 min。从5个独立40倍镜视野下观察过膜的细胞，每个实验重复3次。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠牙髓炎随LPS刺激时间增长而加重

当LPS刺激大鼠牙髓8 h内，成牙本质细胞排列轻度紊乱，穿髓孔局部可见少量炎症细胞浸润，血管内少量红细胞，根髓基本正常。而当LPS刺激大鼠牙髓1 d后，成牙本质排列紊乱，整个冠髓可见炎症细胞浸润，纤维蛋白渗出，血管明显扩张充血。当LPS处理3 d、7 d时，炎症进一步进展，冠髓及根髓可见大量的炎症细胞浸润，部分冠髓液化坏死，小脓肿形成，血管明显增多，其中可见大量红细胞淤积(图1)。

2.2 EZH2的表达随炎症反应加重而上升

免疫组织化学染色结果显示，在正常大鼠牙髓组织,成牙本质细胞层及固有牙髓中可见EZH2的阳性表达散在分布。在LPS刺激大鼠牙髓8 h内，EZH2的表达降低；在LPS刺激大鼠牙髓1 d、3 d、7 d后，随牙髓炎症反应加重，EZH2的表达逐步上升(图2)。

2.3 EZH2及CD68在牙髓组织中的共定位

为了探讨EZH2与巨噬细胞趋化作用之间的关系，本实验进行了EZH2与CD68的免疫荧光双染，其中，CD68为巨噬细胞表面标志物。研究结果显示，与对照组相比，炎症牙髓中EZH2及CD68的表达显著上调，且在炎症牙髓和正常牙髓中均可以检测到二者的共定位(图3)。

2.4 CCK-8细胞增殖-毒性检测结果

为了筛选EZH2重组蛋白刺激THP-1细胞及hDPCs的适宜浓度，本实验分别对两种细胞进行了CCK-8细胞增殖-毒性检测。结果显示，对于THP-1细胞，EZH2重组蛋白在1～40 μg/L的浓度范围内均未对THP-1细胞显示出显著的毒性作用(图4A)；但对于hDPCs，当刺激浓度小于20 μg/L时，hDPCs与对照组相比具有较好的增殖活性。当EZH2重组蛋白浓度达到40～100 μg/L时，细胞增殖活性显著降低(图4B)。因此，本研究选择EZH2重组蛋白浓度为20 μg/L。

2.5 EZH2处理的hDPCs促进巨噬细胞迁移

为进一步探讨EZH2与巨噬细胞趋化作用的关系，本实验使用加入或不加入EZH2重组蛋白的hDPCs上清液对THP-1巨噬细胞进行细胞迁移实验。结果证实，与对照组上清液相比，加入EZH2重组蛋白后的hDPCs上清液能够显著促进THP-1巨噬细胞趋化(图5)。

3 讨论

既往有研究证实EZH2可以通过调节细胞因子的表达促进牙髓炎的进展，并进一步通过体内实验证实EZH2可以通过表观遗传途径促进单核巨噬细胞趋化因子CCL2的表达[5, 11]，但目前尚不清楚牙髓炎进展过程中EZH2表达的变化及其与巨噬细胞趋化作用的关系。本研究通过体内实验和体外细胞实验进一步证实EZH2参与了牙髓炎发展过程，并促进巨噬细胞的趋化。

由于本实验旨在探究EZH2在牙髓炎进展中的作用，因此需要建立不同炎症阶段的大鼠牙髓炎模型。根据牙髓炎组织学评价标准，吴晓恋等[18]结合了Adrian等[19]及王勤等[20]的分级方法，将牙髓病理变化分为4级：0级，牙髓无组织变化；1级，轻度反应，成牙本质细胞层轻度排列紊乱，血管内少量红细胞；2级，中度反应，成牙本质细胞层排列紊乱，血管扩张明显，管腔内较多红细胞；3级，重度反应，牙髓组织凝固性坏死，成牙本质细胞层排列成网状，牙髓血管明显增多，管腔内大量红细胞甚至淤血。常见的大鼠牙髓炎模型的建立方法有穿髓孔暴露法、LPS诱导法、龋牙本质置入法[16, 21]。本实验选取LPS诱导法建立大鼠牙髓炎模型，且在LPS诱导时各组使用一致的浓度(10 g/L)刺激，并用封闭材料封闭洞口，尽可能地控制混杂因素的干扰，使各组间具有较好的可比性[17]。本实验中，LPS刺激大鼠牙髓8 h内大鼠牙髓符合轻度牙髓炎表现；当LPS刺激1 d时，大鼠牙髓表现出了中度牙髓炎症反应的特征；而当LPS刺激第3天和第7天时，大鼠牙髓则发生了重度炎症反应。由此可见，本实验成功建立了不同炎症阶段的大鼠牙髓炎模型。

免疫组织化学染色结果显示，正常大鼠牙髓组织中有少量EZH2表达，在牙髓炎早期(LPS刺激大鼠牙髓8 h内) EZH2的表达降低；在LPS刺激大鼠牙髓1、3、7 d后，随牙髓炎症反应加重，EZH2的表达逐步上升。EZH2在牙髓炎早期表达降低可能与炎症早期的抗炎机制有关，尚需进一步的实验来验证，而晚期升高则提示，EZH2在牙髓炎进展中可能有促炎的调控作用。Hui等[11]通过体外细胞实验证实，EZH2复合物刺激能使hDPCs炎症因子表达上调。Yadav等[13]研究表明，EZH2可以通过调节脊髓背角的神经炎症在大鼠神经性疼痛的持续和发展中发挥重要作用；EZH2抑制剂能够抑制大鼠脊髓背角的EZH2、H3K27me、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、CCL2等促炎因子表达，并能够缓解痛觉敏感症状。以上实验均证实EZH2能发挥促炎的调控作用，与本实验结果一致。然而，亦有研究报道肠黏膜上皮EZH2对实验诱导的炎症性肠病有很强的保护作用[15]，与本研究结果截然相反，可能是EZH2作用于不同细胞所引起的不同结果。Hui等[5]通过染色质免疫共沉淀分析发现，EZH2重组蛋白刺激hDPCs导致IL-6、IL-8、CCL2启动子处H3K27me3缺失，从而使靶基因处于激活状态。而在炎症性肠病，EZH2基因敲除的肠上皮细胞中H3K4me3较H3K27me3更多地占据了靶基因的启动子，从而使靶基因被激活[15]。由此可见，EZH2作用于不同的细胞会引起靶基因产生不同效应，其中的机制还有待进一步探索。

巨噬细胞在维持组织稳态及调节先天性和获得性免疫中起关键作用，是参与牙髓炎的主要细胞之一，其向炎症部位的趋化有利于病原物质的清除，但过度的趋化又会使牙髓炎进一步发展。本研究发现，炎症牙髓中EZH2及巨噬细胞表面标志物CD68的表达显著升高，且可检测到二者的共表达，提示EZH2可能与巨噬细胞的趋化作用相关。CCK-8细胞增殖-毒性检测中，由于需要提取加入刺激后hDPCs的上清液，并用其对THP-1细胞进行Transwell迁移实验，因此，需选取能使两种细胞均具有较好细胞活性的EZH2重组蛋白浓度，本研究最终选择的EZH2重组蛋白浓度为20 μg/L。进一步的Transwell细胞迁移实验结果证实，EZH2重组蛋白刺激hDPCs后的上清液能够促进巨噬细胞的趋化。因此，可以推测EZH2是通过调节巨噬细胞的趋化而控制牙髓炎的发展，但其中的机制尚不明确。近年来，诸多研究证实EZH2能够促进巨噬细胞趋化因子CCL2的表达[5, 13]。Gunawan等[22]的研究发现，EZH2可以通过将蛋白踝蛋白(talin)直接甲基化的核外机制调节炎症细胞的粘附和趋化。EZH2在牙髓炎中促进巨噬细胞趋化作用的机制还需要进一步的探索。

综上所述，本研究初步证实EZH2参与了牙髓炎的发展过程，并促进巨噬细胞的趋化，提示EZH2可能通过调节巨噬细胞趋化调控牙髓炎发展。EZH2可能对牙髓炎具有重要的调控作用，有望成为牙髓炎治疗的新策略。