Tribbles同源蛋白3抑制人脂肪间充质干细胞成脂向分化

白向松，吕珑薇，周永胜

(北京大学口腔医学院 ·口腔医院，修复科 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081)

近年来，因肿瘤、外伤、先天畸形等原因导致的软组织缺损是临床常见的疾病类型，并逐渐引起人们的重视。脂肪组织工程是目前治疗软组织缺损的前沿治疗方法[1]。1999年，Patrick等[2]以复合聚乙醇酸为支架，运用前脂肪细胞成功实现脂肪再生，为脂肪组织工程临床转化奠定了前期研究基础。种子细胞、成脂诱导因子和支架材料是脂肪组织工程的三大要素[3-4]。运用脂肪组织工程可以有效避免假体植入带来的受体免疫排斥反应，并且相比于传统自体软组织皮瓣移植，具有无需损伤自身供区组织的明显优势。2001年，Zuk等[5-6]报道了脂肪提取(processed lipoaspirate, PLA)细胞中存在一种来源于间充质、具有多向分化潜能的成体干细胞，即人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hASCs)。hASCs具有多系分化潜能，可以通过抽吸脂肪技术大量获得， 在脂肪组织工程中具有重要应用前景[6-8]。明确hASCs成脂向分化过程中的重要调控因子，并探索促进hASCs的成脂向分化的新途径，将为实现以hASCs为基础的脂肪组织工程的临床转化提供重要理论基础。

Tribbles同源蛋白3(Tribbles pseudokinase 3, TRIB3)是假性蛋白激酶Tribbles同源蛋白家族成员，其编码基因位于人类染色体20p13-p12.2。TRIB3之所以被归为假性激酶，是因其中心激酶样结构域虽与丝/苏氨酸蛋白激酶结构域相似，但却在重要催化位点存在氨基酸替代，导致TRIB3缺少经典激酶结合Mg2+的天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸氨基酸残基(Asp168-Phe169-Gly170, DFG)结构域,并缺少与三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)结合的富甘氨酸环[9]。与此同时，TRIB3中心激酶样结构域内仍存在赖氨酸残基ATP结合域以及天冬氨酸残基催化域，作为假性激酶虽然其激酶活性较低，但却能与蛋白激酶Akt、活化转录因子4、CCAAT增强子结合同源蛋白、核因子κB等结合，在多个重要分子生物学通路中起到重要调控作用，将体内平衡与代谢性疾病联系起来，因此被认为是体内重要的“应激调控开关”[9-10]。目前研究证实，TRIB3在糖尿病、高脂血症、动脉粥样硬化、阿尔兹海默病以及肿瘤等疾病的发生发展中起到重要作用[11-14]。TRIB3参与脂代谢调节，抑制3T3-L1前脂肪细胞成脂分化和成熟脂肪细胞中的脂肪堆积，是研究肥胖、高脂血症等多种脂代谢异常疾病发病机制和治疗的重要方向[15-17]，但TRIB3在再生医学领域中的潜在应用价值目前仍缺乏报道。

TRIB3参与糖代谢、脂代谢等重要生物学过程，作为调节体内平衡的重要调控因子，其对间充质干细胞分化的影响，尤其是TRIB3对hASCs分化的影响尚未见报道，因此，本研究旨在明确TRIB3在hASCs成脂向分化中的调控作用，通过敲低和过表达TRIB3，研究TRIB3对hASCs成脂向分化能力的影响，明确TRIB3在再生医学领域的潜在应用价值，为软组织缺损的治疗提供了新靶点与新思路。

1 资料与方法

1.1 hASCs

原代hASCs购自美国ScienCell公司，货号7510，本研究采用三株来源于不同供体的hASCs，批号分别为8278、11537、19882，传代培养至第2代用于实验。

1.2 试剂与材料

改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青-链霉素双抗、胰蛋白酶购自美国Gibco公司。细胞培养皿等耗材来自苏州海狸生物医学工程有限公司。油红O染色粉剂(O8010)购自北京索莱宝科技有限公司。TRIzolTM试剂购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自日本Takara Bio公司。放射免疫沉淀测定(radioimmune precipitation assay, RIPA)裂解液购自北京华兴博创公司，蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phennylmethanesulfonyl fluoride, PMSF，101594297)购自美国Sigma公司。鼠源抗人TRIB3抗体(sc-271572)购自美国Santa Cruz公司，兔源抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体(HX1832)购自北京华兴博创公司，山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG，ZB-2301)、抗鼠IgG(ZB-2305)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量试剂盒(23228)购自美国Thermo Scientific公司。

1.3 hASCs体外培养和成脂诱导

hASCs 培养于含5%(体积分数)CO2+ 95%(体积分数)空气的37 ℃ 恒温培养箱中。增殖培养基(proliferation medium, PM)成分为：DMEM培养基+10%(质量分数)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)+ 1%(质量分数)青-链霉素， 2 d更换一次培养基，7 d左右细胞生长至70%～80%汇合状态，随后进行细胞传代。每个培养皿(直径10 cm)中的细胞经胰酶消化、培养基中和、离心、重悬后，接种至3个培养皿(直径10 cm)， 6～7 d汇合度达到80%～90%，再次进行传代。hASCs生长至70%～80%汇合度后加入成脂肪诱导培养基(adipogenic medium, AM)， 成分为：DMEM + 10%(体积分数)FBS + 0.5 mmol/L 异丁基黄嘌呤+1 μmol/L 地塞米松+10 μmol/L 胰岛素 + 200 μmol/L 吲哚美辛 + 1%(质量分数)青-链霉素。根据是否进行成脂诱导，hASCs分为成脂诱导组(AM组)和增殖培养组(PM组)。

1.4 慢病毒转染hASCs

设计四组慢病毒序列，分别为TRIB3敲低(shTRIB3)及其对照(sh-NC)、TRIB3过表达(TRIB3 overexpression，TRIB3-over)及其对照(NC over-expression，NC-over)， 慢病毒订购于上海吉玛制药技术有限公司，转染hASCs P2细胞。转染条件为：慢病毒滴度为5×108TU/mL，慢病毒用量0.1 mL，转染细胞量为1×106个，转染复数(multiple of infection, MOI)= 50，加入终浓度是5 mg/L的嘌呤霉素(polybrene)增强转染效率。24 h后将慢病毒液更换为新鲜的增殖培养基。慢病毒包装碱基序列信息见表1。

由于慢病毒携带的质粒载体中含有绿色荧光蛋白和抗嘌呤霉素基因，故转染后培养基中均加入1 mg/L的嘌呤霉素进行筛选，转染后3 d于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光，评估转染效率。慢病毒转染效果评价包括shTRIB3、TRIB3-over转染hASCs 后，各自mRNA 和蛋白水平的表达情况，分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)和Western blot实验检测。所有细胞实验均重复至少三次。

1.5 油红O染色及定量

hASCs培养于六孔板中，成脂诱导14 d、21 d，10%(质量分数)甲醛固定1 h；弃甲醛，PBS冲洗3遍，60%(体积分数)异丙醇润洗、晾干。用100%(体积分数)异丙醇配制0.35%(质量分数)的油红O储存液，以3 ∶2(油红O储存液 ∶双蒸水)的比例稀释储存液，配制成油红O工作液。孔板内加入油红O染色工作液，室温避光放置10～15 min，弃染液，在显微镜下观察、拍照。以胞浆中出现红染脂滴判断染色为阳性。向染色后的各孔板中加入等量100%异丙醇将油红O染色溶解，室温放置1 h，于500 nm波长下测量光密度值，进行油红O染色定量分析。

1.6 qRT-PCR

TRIzolTM提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以SYBR GREEN进行qRT-PCR，检测成脂相关基因和TRIB3的mRNA表达，引物序列见表2。采用ΔΔCt 法分析数据，以GAPDH作为内参照。

1.7 Western blot

用含蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phennylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的放射免疫沉淀测定(radioimmune precipitation assay, RIPA)裂解液提取细胞总蛋白，总蛋白定量按照美国Thermo公司二辛可宁酸(bicinchonininc acid, BCA)定量检测试剂盒说明书进行。蛋白样品中加入上样缓冲液，煮沸，电泳。浓缩胶80 V，进入分离胶后改为120 V。100 V恒压转膜 2.5 h。5%牛奶(质量分数)室温封闭1 h。将一抗按照体积比1 ∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜。TBST洗3次后，加入对应的二抗，室温孵育1 h。TBST洗3次后，显色、曝光。

1.8 统计学分析

运用SPSS 20.0进行统计分析。比较两组间结果采用t检验，P< 0.05为差异有统计学意义，所有实验数据均以3次重复结果的均数±标准差来表示。

表1 慢病毒碱基序列Table 1 Packaging base sequences of lentiviruses

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

GAPDH，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；TRIB3，Tribbles pseudokinase 3；PPARγ，peroxisome proliferator-activated receptor γ；C/EBPα，CCAAT/enhancer binding protein α；LPL，lipoprotein lipase；CD36，cluster of differentiation 36.

2 结果

2.1 构建TRIB3敲低的hASCs细胞系

构建TRIB3敲低(shTRIB3)及对照(sh-NC)hASCs细胞系，慢病毒转染后3 d在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白强度及分布，转染效率约为80%(图1A)。shTRIB3细胞TRIB3mRNA表达量较sh-NC细胞下降84.3%(P<0.01，图1B)，TRIB3蛋白表达也显著下降(图1C)，表明成功构建了TRIB3敲低的hASCs细胞系。

2.2 敲低TRIB3促进hASCs成脂向分化

油红O染色可见，成脂诱导14 d和21 d，shTRIB3细胞较sh-NC细胞胞浆内红色脂滴明显增多(图2A)；定量结果显示shTRIB3油红O着色较sh-NC显著增多(P<0.01，图2B)。成脂诱导7 d和14 d，qRT-PCR检测成脂分化相关基因PPARγ、CD36和C/EBPα表达水平，结果显示shTRIB3较sh-NC成脂相关基因表达显著升高(P<0.01, 图2C)， 因此，敲低TRIB3促进hASCs成脂向分化。

2.3 构建TRIB3过表达的hASCs细胞系

将TRIB3过表达(TRIB3-overexpression, TRIB3-over)及其对照组(NC-overexpression, NC-over)慢病毒转染hASCs，转染后3 d在倒置荧光显微镜下观察转染质粒中绿色荧光蛋白在细胞中的表达情况，估计转染效率达70%左右(图3A)。qRT-PCR检测证实，过表达组TRIB3mRNA表达量较NC-over组增高约1.6倍(P<0.01, 图3B)， TRIB3蛋白表达也显著升高，表明成功构建了TRIB3过表达的hASCs细胞系(图3C)。

2.4 过表达TRIB3抑制hASCs成脂向分化

成脂诱导14 d和21 d(图4A)，油红O染色可见TRIB3-over细胞较NC-over细胞胞浆内红色脂滴明显减少；定量结果同样显示TRIB3-over油红O着色较NC-over显著下降(P<0.01，图4B)。成脂诱导14 d和21 d，qRT-PCR检测成脂分化相关基因PPARγ、CD36和LPL表达水平，可见TRIB3-over较NC-over成脂相关基因表达显著降低(P<0.01，图4C)，因此，过表达TRIB3抑制hASCs成脂向分化。

3 讨论

脂肪组织工程是修复软组织缺损的前沿治疗方法。当前，脂肪组织工程开展的主要方法包括，支架引导、复合物注射、破碎网膜引导和从头合成脂肪再生[18]。种子细胞是脂肪组织工程的重要组成部分。hASCs具有较强的增殖能力和多系分化潜能，且取材简易，来源丰富，是较为理想的种子细胞类型[7,19]。然而，在脂肪再生的研究中，hASCs也存在一些尚未解决的问题，包括随着体外增殖和成脂诱导时间的延长，hASCs成脂分化能力逐渐减弱，新生脂肪量较少，不能满足脂肪组织重建的要求[20-21]。因此，如何提高hASCs成脂分化能力是基于hASCs的脂肪组织工程脂肪再生研究的重要内容[22-24]。

TRIB3在糖代谢、脂代谢等重要生物学过程中起到重要作用[25-26]。TRIB3在糖代谢中的作用表现为TRIB3高表达导致胰岛素抵抗，其作用机制与Akt通路相关。作为假性激酶，TRIB3可与Akt的丝氨酸(Ser)473位点和苏氨酸(Thr)308位点直接结合，抑制Akt在Ser473位点的磷酸化，从而抑制Akt活性。Akt起到糖摄入时抑制肝糖原释放的重要作用；空腹时，TRIB3对Akt活性的抑制促进肝糖原释放[27-28]，病理状态下TRIB3的过度高表达导致肝糖原分解过多，进一步加重高血糖与胰岛素抵抗现象，因此发挥对胰岛素作用的抑制作用[29]。胰岛素可以促进前脂肪细胞成脂分化和成熟脂肪细胞中的脂肪堆积，TRIB3对胰岛素代谢的抑制作用导致其对脂肪代谢过程也起到抑制作用[15],因此，TRIB3在脂代谢和脂肪细胞分化过程中的作用与其在胰岛素代谢中的作用有关。

TRIB3作为调节体内平衡的重要调控因子，有望成为调控hASCs成脂向分化的重要靶点，但TRIB3对hASCs成脂向分化影响的研究尚未见报道。本研究通过慢病毒转染建立了稳定敲低、过表达TRIB3的hASCs细胞系。通过油红O定性染色、油红O定量和qRT-PCR等实验发现，在成脂诱导条件下，敲低TRIB3可以显著促进hASCs成脂向分化，过表达TRIB3抑制hASCs成脂向分化，明确了TRIB3在hASCs成脂向分化中的重要作用。现有的研究显示，多种信号通路参与调节hASCs的谱系定向分化，hASCs成脂向分化与成骨向分化存在一定的拮抗关系[30-33]，因此，在hASCs成脂分化能力受到抑制的同时，其成骨分化能力可能增强，这一趋势有待进一步的深入研究。TRIB3影响hASCs成脂分化的具体分子机制还有待进一步探索。既往研究揭示了PPARγ是TRIB3参与脂代谢调节和前脂肪细胞分化的重要调控分子。在本实验中，未成脂诱导时，过表达TRIB3组(TRIB3-over)较对照组(NC-over)PPARγ表达明显下降；成脂诱导后，敲低TRIB3组(shTRIB3)较对照组(sh-NC)PPARγ表达显著升高，过表达TRIB3组(TRIB3-over)较对照组(NC-over)PPARγ表达明显下降。这一研究结果提示TRIB3参与调节hASCs成脂向分化的分子机制很可能与PPARγ通路相关，为下一步的深入研究提供了方向。

TRIB3在脂肪细胞正常成脂分化过程中表达水平的变化是研究其在脂肪细胞分化中作用的重要组成部分。研究发现[17, 34]，3T3-L1前脂肪细胞细胞分化成熟过程中TRIB3蛋白表达呈现与mRNA不同的变化趋势。在成脂向分化过程中TRIB3mRNA水平呈现先下降后上升的变化趋势。未经成脂诱导时(成脂诱导0 d)TRIB3mRNA水平较高，约为前脂肪细胞中TRIB3mRNA最大表达量的40%，0 d到2 dTRIB3mRNA逐渐减少，其后随着成脂诱导时间延长，直至成脂诱导14 dTRIB3mRNA水平保持稳定上升。另一方面，TRIB3蛋白0 d水平较低，成脂分化过程中表达始终稳定上升。TRIB3蛋白与mRNA水平表达变化趋势的区别提示，3T3-L1前脂肪细胞细胞中TRIB3表达可能存在转录后调控机制。

事实上，TRIB3作为体内重要的平衡调节因子，其转录后调控存在多种形式。有关TRIB3的上游调控机制研究发现，TRIB3是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)中miR-24[35-36]、miR-96[10,37]的有效靶点。miR-24、miR-96可与TRIB3转录本的3′非编码区(3′-untranslated region, 3′-UTR)的不同位点相结合，抑制TRIB3蛋白表达。此外，在一项关于Jurkat T细胞的研究中，通过基因芯片技术筛选出miR-219-5p可与TRIB3靶向结合，抑制TRIB3表达[38]。针对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的研究发现，miR-124可直接靶向抑制TRIB3表达，在NAFLD发病机制中起到重要作用[39],因此，多种miRNAs可与TRIB3靶向结合，抑制TRIB3表达，在多种生物学过程中起到重要作用。目前，尚没有研究报道hASCs中miRNAs对TRIB3的转录后调控，能否通过调控hASCs中miRNAs水平调节TRIB3表达，并进一步促进hASCs成脂向分化，具有重要研究意义。更深入的研究有必要通过基因芯片、双荧光素酶报告基因实验等多种实验方法，发现、验证hASCs中与TRIB3靶向作用的调控分子，并明确miRNAs与TRIB3相互作用对hASCs成脂向分化的影响。