丹黄消炎液对糖尿病小鼠创面组织中HIF1-α及VEGF 表达的影响

刘国涛，王 军，周 玉，卢增珍

慢性创面难愈是糖尿病最常见的并发症之一，往往反复发作、迁延不愈、治疗费用高[1]。现代研究表明，糖尿病创面血管新生的主要机制与低氧诱导因子1-α（HIF1-α）/血管内皮生长因子（VEGF）轴密切相关[2]。虽然表皮生长因子类凝胶可以促进创面VEGF 的表达，但不适用于伴有感染的糖尿病创面[3]。祛瘀生肌类中药不仅可以促进创面坏死组织的脱落，还可以促进VEGF 表达[4]。课题组前期临床研究表明，丹黄消炎液外敷对糖尿病创面具有很好的疗效[5]，但具体作用机制尚不明确。本研究通过建立I 型糖尿病小鼠创面模型，探讨丹黄消炎液通过HIF1-α/VEGF 治疗糖尿病创面的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF 级雄性BALB/c 小鼠共60 只，8周龄，体质量（19±2）g，由中国食品药品检定研究院提供，实验动物许可证号SCXK（京）2014-0013。

1.2 药物 丹黄消炎液为天津中医药大学第一附属医院院内制剂，由天津中医药大学中医药研究院提供（主要成分：黄芪、丹参、皂角刺、当归、银花、大黄、关黄柏。其中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄甲醚的总含量不少于生药的1.5%），每克含生药6.67 g。0.9%氯化钠溶液，国药准字：H37022336，山东辰欣药业股份有限公司。医用碘伏，国药准字：20180811，山东利尔康医疗科技股份有限公司。

1.3 主要试剂及仪器 链脲佐菌素（STZ，批号：Y161101），北京索莱宝科技用有限公司；柠檬酸（批号：20180401），天津大茂化学试剂厂；柠檬酸钠（批号：20180509），天津大茂化学试剂厂；异氟烷（批号：045740），深圳市瑞沃德生命科技有限公司；血糖试纸（批号：4527442），上海强生医疗器械有限公司；血糖仪（AW0647775005A）,上海强生医疗器械有限公司；AKT 一抗：北京博奥森生物技术有限公司。β-actin 内参抗体：天津赛尔生物有限公司。辣根过氧化酶（HRP）标记二抗：天津赛尔生物有限公司。Epgiadients PCR 仪：Eppendorf 公司。ABI 7500 fast 荧光定量PCR 仪：Life Technologies 公司。

1.4 I 型糖尿病小鼠模型的建立 随机选取10 只小鼠作为正常组，余50 只禁食不禁水16 h，称重后用一次性无菌1 mL 注射器以60 mg/kg 将1%的STZ 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液经腹腔注入小鼠体内，连续5 d；对照组10 只腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。1 周后将随机血糖＞16.7 mmol/L的小鼠挑出，此次实验成功制作I 型糖尿病小鼠40 只[6]。

1.5 创面模型的建立 取I 型糖尿病小鼠40 只与正常组小鼠10 只，参考文献[7]方法用动物剃毛器在背部刮出25 mm×25 mm 区域，用脱毛膏脱去剩余毛发，正常饲喂1 d。然后将小鼠以4%的异氟烷诱导麻醉，将小鼠俯卧位固定，以3%异氟烷维持麻醉。稍用力拉伸小鼠一侧腰背部皮肤使之拉伸变平，用15 mm×15 mm 的印章标记，局部碘伏消毒，用眼科剪沿着边缘剪去全层皮肤，医用无菌敷料贴敷，自粘型弹力绷带固定，分笼饲养。

1.6 分组与给药 将造模成功的糖尿病创面小鼠随机挑选30 只采用区组随机法分为模型组、阳性药组、中药组，每组10 只，正常组10 只。模型组、正常组用生理盐水1 mL/只外敷，阳性药组用碘伏1 mL/只外敷，中药组丹黄消炎液1 mL/只外敷，医用自粘绷带包扎，连续用药7 d。

1.7 观察指标及方法 分组后检测各组小鼠血糖：下午14：00 先用75%酒精棉球消毒鼠尾皮肤和眼科剪，待酒精挥发后剪破鼠尾尾尖1 mm，擦去第一滴血，用血糖试纸检测小鼠尾巴第二滴血，记录读数并于小鼠尾部涂布红霉素软膏以防感染；给药7 d 后对小鼠进行麻醉，计算各组创面愈合面积：用数码相机固定距离(30 cm)、固定焦距、固定标尺下照片，并用Image J 软件计算治疗愈合面积。

1.8 病理学染色 给药7 d 后收集各组小鼠创面部位皮肤组织，HE 染色观察各组小鼠创面组织病理学变化；此外，运用Masson 染色观察各组小鼠创面纤维组织分布及含量。

1.9 荧光定量PCR 检测HIF1-α 及VEGF mRNA表达水平 造模给药后，提取各组小鼠创面皮肤中总RNA，反转录合成cDNA，采用SYBR Green Real Time RT-PCR 试剂盒进行扩增，检测各组小鼠创面皮肤组织中HIF1-α 及VEGF mRNA 表达，以β-actin 为内参，具体引物序列见表1。

表1 引物序列

1.10 免 疫 组 化 检 测CD31、HIF1-α 和VEGF蛋白表达水平 造模给药后，运用免疫组化法检测各组小鼠创面皮肤组织中CD31、HIF1-α 和VEGF 蛋白表达水平。

1.11 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料采用表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血糖水平比较 阳性药组、中药组和模型组的小鼠血糖值显著高于正常组（P＜0.01），阳性药组、中药组和模型组间的小鼠血糖值差异无统计学意义，均符合I 型糖尿病小鼠模型的评定标准[6]，见表2。

表2 各组小鼠血糖水平比较

2.2 各组小鼠治疗后创面愈合面积比较 正常组、阳性药组和中药组的创面愈合面积均大于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），且中药组创面愈合面积大于正常组和阳性药组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠创面愈合面积比较

2.3 治疗7 d 后各组创面病理切片HE 染色结果 HE 染色可见各组组织损伤处大面积坏死，表皮、真皮结构不清，局部可见出血（红色箭头）；脓细胞渗出（黄色箭头）：模型组＞正常组＞阳性药组＞中药组；嗜酸性丝网状或均质状（黑色箭头）：模型组＞正常组＞阳性药组=中药组。炎性细胞浸润（橙色箭头）：模型组＞正常组＞阳性药组＞中药组；肉芽组织内纤维结缔组织（绿色箭头）：模型组＜正常组＜阳性药组＜中药组；新生毛细血管（蓝色箭头）：模型组＜正常组＜阳性药组＜中药组，见图1。

图1 各组治疗7 d 后小鼠创面组织的HE 染色图

2.4 治 疗7 d 后 各 组 创 面Masson 染 色 结果 Masson 染色可见各组组织损伤处大量肌纤维组织，与模型组相比，其余各组创面组织中纤维组织显著增多且排列致密，其中正常组最为明显，中药组和阳性药组次之，见图2。各组肌纤维容积分数，与模型组相比，正常组、阳性药组和中药组肌纤维容积分数显著增加，且中药组的肌纤维容积分数高于阳性药组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组小鼠的肌纤维容积分数比较

2.5 各组小鼠创面组织中HIF1-α、VEGF mRNA水平比较 与模型组相比，正常组、阳性药组、中药组HIF1-α mRNA 和VEGF mRNA 表达水平显著上调，且中药组的HIF1-α、VEGF mRNA 表达水平高于阳性药组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 各组治疗7 d 天后小鼠创面HIF1-α、VEGF mRNA 表达水平（n=6）

2.6 各组小鼠创面组织中CD31、HIF1-α、VEGF 表达水平比较 CD31 主要表达于毛细血管部位，见图4，与模型组相比，正常组、阳性药组、中药组小鼠创面组织中 CD31 显著增加，且中药组高于阳性药组，差异有统计学意义（P＜0.05）。HIF1-α 及VEGF 主要表达于纤维组织与血管内皮细胞的细胞质中（见图5、6）。与模型组相比，正常组、阳性药组及中药组创面组织中HIF1-α及VEGF 阳性表达水平显著增加（P＜0.05）。中药组的HIF1-α 与阳性药组相比无统计学差异，但两组HIF1-α 蛋白阳性表达水平均低于正常组（P＜0.05）；中药组创的VEGF 蛋白表达水平显著高于阳性药组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

图4 各组小鼠创面组织中CD31 免疫组化染色（×100）

图5 各组小鼠创面组织中HIF1-α 免疫组化染色（×100）

图6 各组小鼠创面组织中VEGF 免疫组化染色（×100）

表5 各组创面组织中CD31、HIF1-α 和VEGF 比较

3 讨论

糖尿病创面愈合缓慢机制尚不明确，造成创面感染、血糖难以控制，尤其是发生在足部的糖尿病创面会引发骨髓炎、败血症等严重危及患者生命的并发症[1]。糖尿病属中医文献中的“消渴”范畴，在此基础上形成的创面可见于中医“脱疽”，《明代外科正宗》又有“若无变证，外无混杂，此十中可保其三四矣；若割取后，黑色仍漫，痛肿尤甚，败恶无脓，口干舌硬，食不知味者终死”记载。当下中医治疗多以固本箍毒、祛腐生新为糖尿病足溃疡治疗原则[8]。中医外治法可以直接作用于创面，具有较好的箍围去腐长肉的功效，且可以减少全身用药对脾胃带来的影响。因此，中医外治法在促进创面愈合方面更具优势。糖尿病创面的病因，起初表现为局部的溃破，气血瘀阻不畅，瘀而化热成脓成腐，导致创面愈合延迟。清热化瘀类中药具有清热利湿、化瘀生肌的作用，同时中药湿敷可以有效减轻创面渗出，使药力深达患处促进肉芽生长，在创面外治中广泛应用。

研究表明，糖尿病会导致严重的并发症，影响身体的各个器官代谢，糖尿病会导致皮肤血管数量减少和VEGF 表达下降，同时糖尿病造成皮肤抗氧化防御水平降低，这是导致皮肤损伤后愈合延迟的潜在原因[9]。各种原因导致糖尿病患者皮肤损伤后，机体修复大致分为止血、炎症、增殖和重塑四个阶段[10]，糖尿病创面炎症阶段肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 白 细 胞 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表达升高，活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增多[11]。在正常的血氧供应条件下，HIF1-α 会迅速羟基化；在低氧组织条件下，HIF1-α 的羟基化减少，非羟基化的HIF1-α 蛋白可以稳定并启动VEGF 基因的表达[12]，而高浓度的ROS 诱导会降低HIF1-α 与其辅酶p300 的结合，导致HIF1-α 反式激活功能下降，使得缺氧诱导的VEGF 表达降低导致新生血管受损[13]。因此，HIF1-α/VEGF 的功能受损是糖尿病患者血管生成障碍和伤口愈合延迟的重要原因。本研究结果提示，糖尿病小鼠创面VEGF 蛋白表达量低于普通小鼠创面；丹黄消炎液治疗后小鼠创面可见CD31、HIF1-α 和VEGF 表达水平升高；HIF1-α和VEGF mRNA 水平增加；然而HIF1-α 和VEGF蛋白免疫组化结果提示糖尿病的某些机制会下调HIF1-α 的表达，治疗后有其他因子或蛋白可以通过不依赖HIF1-α 的方式增加VEGF 的表达。课题组前期临床研究表明，丹黄消炎液外敷不仅能有效控制创面感染，还可以有效促进伤口缩小,促进创面趋向愈合，提示创面感染可能是导致这种现象的原因之一[14]。

文献报道，黄芪可以提高创面VEGF 的表达并促进愈合[15]。其有效成分黄芪甲苷IV 可以刺激细胞迁移，并上调HIF1-α 表达促进血管生成[16]。丹参有效成分丹参酮IIA 通过促进HIF1-α 和VEGF 因子的表达对缺血组织产生保护作用[17]。与单体药相比，丹参黄芪药可以从创面愈合的多阶段多靶点干预VEGF 表达[18]。目前，中医外治法治疗糖尿病创面的常见机制有：抑制晚期糖基化终产物诱导的细胞凋亡和细胞功能障碍，促进巨噬细胞的转型，激活Wnt/β-catenin 通路抑制糖原合成酶3β 的活性等[19-20]。糖尿病创面及周围的成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等，可分泌多种生长因子，包括转化生长因子-β1、胰岛素样生长因子-1、表皮生长因子等，通过激活相应的通路，促进创面的愈合[21]。本研究结果显示，糖尿病模型小鼠创面VEGF、HIF1-α 的表达下调，提示糖尿病模型小鼠出现了创面愈合延迟，这与现在的研究结果一致。丹黄消炎液外敷可以增加CD31 的荧光强度，表明血管生成增多；同时可以促进创面VEGF、HIF1-αmRNA 表达，促进创面愈合。临床研究发现，在患有2 型糖尿病和糖尿病足的患者的血液循环和组织活检中，血管生成因子SDF-1α 均显着降低[22]。这说明基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）可能通过激活HIF1-α/VEGF 信号通路参与了糖尿病创面的愈合过程。糖尿病创面是机制复杂的慢性创面之一，中医中药对慢性创面的促愈也是从多通路、多靶点来发挥作用的[23]。本方对创面愈合的其他蛋白或通路是否有促进作用，尚需将进行更深层次的课题研究和临床验证。