加味旋覆代赭汤对非酸反流所致慢性食管病变大鼠肠化及CDX2、DLK1 表达的影响

唐丽明，宋 宁，张桂贤，熊 鹰，刘大卫，杜红跃，袁红霞

Barrett 食管（Barrett' s esophagus, BE）是指被覆在食管下段的正常复层鳞状上皮被肠化柱状上皮所取代的病理现象，是食管腺癌的主要癌前病变之一[1-4]。胃酸及胃蛋白酶被公认是引起BE 的主要因素，但质子泵抑制剂（PPI）二十多年的广泛使用，并未降低BE 和食管腺癌发病率，反而有升高趋势。随着食管24 小时pH 检测及胆汁反流监测技术的推广，发现反流到食管内的内容物混有十二指肠液（其中含有胆汁），如国外报道半数以上BE 患者食管反流物中含十二指肠内容物（含胆汁），因此非酸反流对食管黏膜的损伤作用逐渐被重视，且随后多项临床和基础研究也证实胆汁在反流性食管炎（RE）、BE 及其并发食管腺癌的发生发展过程中起重要作用[5-8]。本研究采用十二指肠-食管吻合术（胃全切）建立大鼠十二指肠-食管非酸反流模型，观察加味旋覆代赭汤对该模型食管肠化及尾型同源盒转录因子-2（CDX2）、DLK1表达的影响，为其临床应用提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF 级成年雄性Wistar 大鼠80 只，体质量180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号11400700347254。

1.2 药物 加味旋覆代赭汤的制备，首先按处方配比，根据该方在《伤寒杂病论》中的剂量换算，取处方量药材饮片：旋覆花15 g，代赭石5 g，清半夏10 g，生姜25 g，人参10 g，炙甘草15 g，大枣15 g，山慈菇15 g，白花蛇舌草30 g（饮片购自天津市中新药业中药饮片厂），由天津市医药科学研究所制剂研究室煎煮浓缩成每克相当于4 g生药的浸膏，用时以蒸馏水稀释成所需浓度备用；铝碳酸镁片（达喜）为拜耳公司产品，规格为500 mg/粒，用时配成10 g/L 浓度溶液。

1.3 主要试剂与仪器 CDX2 抗体、DLK1 抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗为美国Abcam 公司产品。EG1150H 型包埋机、RM2235/2245 切片机、ASP300 脱水机、DM400B正置显微镜为德国Leica 公司产品。

1.4 大鼠十二指肠-食管吻合术（胃全切）非酸反流模型建立 在“十二指肠-胃-食管反流大鼠模型”[9]基础上结合文献[10]加以改良，即采用“结合胃全切的十二指肠-食管吻合术”建立“大鼠十二指肠-食管非酸反流模型”（造模25 周），以提高十二指肠内容物反流程度，提高食管下端BE发生率（见图1）。

图1 十二指肠-食管吻合术（胃全切）大鼠模型示意图

1.5 动物分组及治疗 成年雄性Wistar 大鼠80只，体重180 ～220 g，随机分为4 组，每组20 只，即假手术组、模型组、加味旋覆代赭汤组、铝碳酸镁片（达喜）组（500 mg/粒，配成10 g/L 浓度）。造模25 周后，加味旋覆代赭汤组经口灌服加味旋覆代赭汤（相当于30 g 生药/kg），每日1 次，连续3 周；达喜照组在造模后25 周开始经口灌服达喜药液（300 mg/kg），每日1 次，连续3 周。

1.6 标本留取及检测指标 治疗3 周后，连同假手术组，共4 组动物，10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠，打开胸腹腔，剪取食管下段及吻合段，纵行剖开食管，进行大体病理观察；对食管下端紧邻吻合口处组织行HE 染色，观察食管病理组织学改变，并按病理组织学诊断标准进行评分[11]；另采用免疫组化法进行CDX2 及DLK1 染色，观察其在肠化生上皮细胞上的表达。免疫组化操作步骤按说明书进行。CDX2 蛋白阳性染色为细胞核染色呈棕黄色颗粒，而DLK1 阳性细胞染色主要位于细胞膜和胞浆内，呈棕黄色，二者主要分布于杯状细胞（肠化生）区域，每张切片随机选取5 个高倍视野，光镜下选择阳性染色区域，采用Image-pro plus（IPP）6.0 软件测量选择区域内的积分光密度（IOD）值，并计算出阳性区域的平均IOD 值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0 软件对本研究数据资料进行统计学分析。计量资料采用表示，两组比较采用t检验；两组间率的比较采用卡方检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察 术后25 ～28 周，模型组存活15只，死亡5 只；加味旋覆代赭汤组存活17 只，死亡3 只；达喜组存活16 只，死亡4 只；假手术组存活19 只，死亡1 只。死亡大鼠均解剖探查，7只死于食管穿孔，不明原因6 只。大体病理观察可见模型组食管下段显著增粗，纵行剖开食管，可见下端食管显著增厚，食管下段黏膜呈广泛显著不规则隆起，外观颜色呈白斑样改变。加味旋覆代赭汤组食管大体病理较模型组显著减轻，达喜组食管大体病理较模型组无显著差异（图2）。

图2 各组大鼠食管大体组织学观察

2.2 食管病理组织学改变 加味旋覆代赭汤组的食管炎症程度较模型组显著减轻（P＜0.01），但达喜组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；加味旋覆代赭汤组BE 发生率显著低于模型组（P＜0.05），但达喜组与模型组差异无统计学意义（P＞0.05）；其他病理改变，如糜烂及溃疡、基底细胞增生、鳞状上皮增生，加味旋覆代赭汤组均较模型组显著减轻（P＜0.05），见表1、图3。

表1 各组大鼠食管病理组织学改变[>n（%）]

图3 各组大鼠食管病理组织学改变（HE 染色，×100）

2.3 CDX2、DLK1 蛋白表达水平 加味旋覆代赭汤组的CDX2、DLK1 表达水平均显著低于模型组（P＜0.01），而达喜组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图4、5。

图4 各组大鼠食管组织CDX2、DLK1 表达（免疫组织化学染色，×100）

图5 各组大鼠食管组织CDX2、DLK1 免疫组化染色平均IOD 值

3 讨论

非酸反流与BE 及食管腺癌发生关系密切。非酸物质中尤其是胆汁酸可通过激活其核受体FXR/CDX2 途径促进胃食管黏膜肠化及癌变。Notch 途径调控上皮增殖细胞向杯状细胞分化。CDX2 为同源异型盒基因家族的成员之一，其编码的蛋白是肠道特异性基因关键调控因子，对肠上皮的分化、增殖以及形态及功能的维持发挥关键调控作用。正常胃黏膜上皮中CDX2 呈阴性，但在慢性萎缩性胃炎的胃黏膜上皮中随杯状细胞等肠道特异性细胞的出现，CDX2 的表达显著增强[12]；而将CDX2 转入正常小鼠胃黏膜上皮细胞，可发生肠上皮化生，提示CDX2 异位表达可能是胃黏膜出现肠上皮表型的始动因子。近年研究发现CDX2蛋白也异位表达于BE[13-14]。反流性食管炎所致的BE 中食管的鳞状上皮被肠上皮所代替，CDX2 的表达亦呈明显增强趋势，提示CDX2 高表达在BE的肠化中可能起重要作用，即CDX2 可诱导细胞向肠上皮分化。

Notch 信号通路由一系列蛋白分子家族组成，包括Notch 受体、其配体、正负修饰分子以及转录因子，参与细胞的生长、增殖、分化等调控过程。Notch 受体和其配体DLK1、DLK2、DLK3、DLK4 是通过细胞之间接触发挥作用[15]。Notch与胃癌和结直肠癌的发病机制密切相关[16]，抑制Notch 信号会导致增殖细胞向杯状细胞分化，而Notch 信号激活将会引起隐窝增殖细胞扩增，并抑制其向分泌型细胞分化。研究发现胆汁酸可通过CDX2 依赖模式激活Notch1/DLK1 信号途径，显示二者之间存在串话（crosstalk）效应，提示在非酸反流所致BE 肠上皮化生过程中，Notch1/DLK1信号途径与CDX2 具有协同交互作用。

本实验采用十二指肠-食管吻合术（胃全切）建立大鼠十二指肠-食管反流模型，在建模28 周时，进行病理组织学观察，吻合口段食管显著增厚，食管下段黏膜呈广泛显著不规则隆起，外观颜色呈白斑样改变，近半数模型大鼠发生了典型BE 表现，并伴显著肠化生（杯状细胞增生），经免疫组织学检查，Notch1 配 体DLK1 表达及CDX2 表达显著增强，与肠化生相关，初步提示CDX2 与Notch1/DLK1 信号途径参与食管上皮肠化生，与BE 发生有关。

目前大部分对BE 的中医治疗，例如对于内镜检查发现食管黏膜呈颗粒样增粗或证实为BE 的患者，多加用山慈菇和白花蛇舌草，在旋覆代赭汤降逆化痰、益气和胃基础上，增加了化痰散结、清热散结的作用[17-18]。本研究模型大鼠经加味旋覆代赭汤治疗后，食管大体病理改变显著减轻；病理组织学检查显示重度食管炎发生率显著降低，糜烂及溃疡、基底细胞增生、鳞状上皮增生等病变显著减轻；BE 发生率也显著降低；免疫组化检测CDX2、DLK1 表达，二者在加味旋覆代赭汤组的表达也均显著低于模型组。因此，本研究结果提示加味旋覆代赭汤可通过抑制CDX2 及Notch信号分子DLK1 表达，从而抑制肠化，减少非酸反流所导致的BE 发生。