偎脓长肉法对大鼠慢性溃疡组织病理学及肉芽组织VEGF、Notch1、TGF-β1 表达的影响

朱朝军，张朝晖，周 冰，张 杨，刘现周，霍 磊，郭 悦

偎脓长肉法是中医外科独具特色的外治法之一，药物经疮周皮肤和疮面肉芽组织的吸收，发挥药疮交互作用，“脓-肉”的变化反映了疮面愈合过程中促修复物质的动态变化[1]。肉芽组织吸收药物中的有效物质后发生一系列变化，产生的“脓”促进创面修复，对于“脓”液中促创面修复物质的研究较多[1]，但对肉芽组织内促创面修复物质的变化研究较少。偎出之脓中含有大量活性的“巨噬细胞”，巨噬细胞与创面愈合关系密切，贯穿创面修复整个过程，可以分泌多种细胞因子，刺激细胞增殖，促进创面血管化、肉芽化，加速胶原沉积[2]。前期研究表明：偎脓长肉法可早期抑制M1 型巨噬细胞诱导的诱导性一氧化氮合酶表达，再促进 M2 型巨噬细胞表型指标精氨酸酶1 表达升高[3]。生肌象皮膏是中医外科常用的偎脓长肉外用药之一，常用于疮面生肌收口阶段。本文观察了偎脓长肉法对肉芽组织内血管内皮细胞 生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Notch1、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD 大鼠24 只，（280±20）g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心[动物许可号：SCXK-(军)2012-0004]。

1.2 药物与试剂 外用药物：生肌象皮膏（批准文号津药制Z20070652 号）：象皮（制）、血余炭、龟甲、地黄、当归、石膏、炉甘石、蜂蜡。功能主治：杀菌、偎脓生肌、收敛。不良反应、禁忌及注意事项均尚不明确。医用凡士林油纱条：新乡华西卫材有限公司。TGF-β1、Notch1、VEGF 抗体均购自天津瑞博星科技有限公司。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌（ATCC25923 株），由北京中医药大学基础医学院国家中医药管理局重点学科免疫实验室提供。菌液中金黄色葡萄球菌含量为（3～5）×109cfu/mL。菌液制备：取金黄色葡萄球菌，在营养琼脂培养基上37 ℃培养24 h 后，取下菌落加适量无菌氯化钠注射液研磨，制成含（3～5）亿个金黄色葡萄球菌/mL 的菌液。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠分组及造模方法 大鼠24 只，随机分为4 组正常组、对照组、模型组、治疗组，每组6只。除正常组外，其他3 组用“激素干预-皮肤缺损-细菌感染”复合因素叠加法制备慢性皮肤溃疡大鼠模型。腹腔注射水合氯醛（10%，0.25 g/kg）麻醉大鼠后，手术剪机械性在背部双侧剪去直径为2 cm 的圆形伤口，深达筋膜层，喷洒1 mL 菌液至伤口上，伤口周围出现红、肿，创面可见脓性分泌物。除正常组外，大鼠造模后肌注醋酸氢化可的松（80 mg/kg），连续3 d 造成难愈性创面模型。

1.4.2 治疗方法 本研究选用具有偎脓生肌作用的生肌象皮膏用于创面换药。大鼠慢性难愈合创面成功后，左侧创面用于取材，右侧创面用于观察愈合情况。治疗组：慢性创面+生肌象皮膏换药；模型组：慢性创面+生理盐水纱条换药；对照组：慢性创面+凡士林纱条换药；正常对照组：不做任何干预。换药时，药膏面积与创面面积相当，药膏厚约1 mm。换药1 次/d，连续治疗14 d。

1.4.3 标本采取 治疗3、7、14 d，治疗组、对照组、模型组取左侧创面。以每个创面为中心，分别取上、下、右侧三个位置。取材时，用无菌手术器械分离、切取1 cm×1 cm 大小组织（含创面肉芽组织及疮周皮肤组织）。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠疮面愈合情况 观察疮面肉芽生长情况，观察疮面的愈合情况，测量疮面的面积。

1.5.2 疮面肉芽组织形态学观察 取材后的组织，常规包埋、石蜡切片，行HE 染色，显微镜下观察疮面组织炎性细胞、毛细血管、成纤维细胞、巨噬细胞等变化。

1.5.3 TGF-β1、Notch1、VEGF 在组织内的表达 免疫组化测定TGF-β1、Notch1、VEGF 在组织内的表达情况，具体方法参照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法 使用SPSS16.0 软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 大鼠疮面面积比较 造模后，治疗组大鼠疮面愈合最快；对照组次之；模型组愈合最慢。治疗3 天时，各组大鼠疮面面积差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗7 天时，与模型组相比，对照组、治疗组面积缩小，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，治疗组面积缩小，差异有统计学意义（P＜0.01）。治疗14 天时，与模型组相比，对照组、治疗组创面明显缩小，差异有统计学意义（P＜0.01）；与对照组相比，治疗组创面面积明显缩小，差异有统计学意义（P＜0.01），创面接近愈合。结果见表1。

表1 4 组大鼠疮面面积比较（cm2）

2.2 疮面组织形态学观察结果 HE 染色光镜观察大鼠治疗不同阶段疮面肉芽组织形态（图1）。正常组大鼠皮肤组织结构较为完整，可见完整表皮层，真皮层毛囊结构，无明显炎性细胞浸润。

治疗3 天：模型组表皮下出血严重，可见大量红细胞（红色箭头所示），组织可见大面积炎症及坏死，炎性细胞多为中性粒细胞和淋巴细胞（黑色箭头所示），未见肉芽组织。对照组组织内可见少量嗜碱性颗粒（蓝色箭头所示），可见少量毛细血管和大量成纤维细胞（黑色箭头所示），并伴有大量炎性细胞浸润（红色箭头所示）。治疗组组织内可见少量毛细血管和大量成纤维细胞（黑色箭头所示），组织内可见少量淋巴细胞浸润（红色箭头所示）。

图1 4 组大鼠疮面组织形态学观察（HE 染色，×100）

治疗7 天：模型组组织内可见少量嗜碱性颗粒（蓝色箭头所示），少量毛细血管和大量成纤维细胞，并伴有少量炎性细胞浸润（黑色箭头所示），可见呈透明样异物，其周围有少量多核巨细胞（如黄色箭头所示）。对照组组织内可见少量毛细血管和大量成纤维细胞，伴有大量炎性细胞浸润（黑色箭头所示）；组织内可见大量形态各异、大小不一的空泡（红色箭头所示）。治疗组组织内可见丰富的毛细血管和大量成纤维细胞（黑色箭头所示），可见大量炎性细胞浸润（红色箭头所示）。

治疗14 天：模型组肉芽组织内可见丰富的毛细血管和大量成纤维细胞，部分毛细血管扩张，毛细血管内可见淤血（黑色箭头所示），近表皮处可见大量纤维素渗出（黄色箭头所示），组织内可见大量炎性细胞（红色箭头所示）。对照组组织内可见丰富的毛细血管和大量的成纤维细胞（黑色箭头所示），可见少量炎性细胞浸润（红色箭头所示）。治疗组溃疡面形成较为成熟的肉芽组织，组织内可见大量的成纤维细胞（黑色箭头所示），表皮完整，未见明显炎性细胞浸润。

2.3 肉芽组织VEGF 表达的比较 在治疗第3 天时，模型组、对照组、治疗组VEGF 的表达量呈升高趋势，与正常组相比，三组的VEGF 表达量差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，对照组、治疗组VEGF 的表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.01），与对照组相比，治疗组VEGF 的表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。在治疗第7 天时，VEGF 的表达量最高，与正常组相比，模型组、对照组、治疗组VEGF 的表达量差异都有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，对照组、治疗组VEGF 的表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与对照组相比，治疗组VEGF 的表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。在治疗第14 天时，与正常组相比，模型组VEGF的表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其他各组间VEGF 的表达量无差异。模型组、对照组、治疗组治疗前后的VEGF 表达均呈现先升高后降低的趋势。结果见表2，图2。

表2 4 组大鼠疮面肉芽组织VEGF 表达变化

图2 4组大鼠治疗7 天时疮面肉芽组织VEGF 表达（×100）

2.4 肉芽组织TGF-β1 表达的比较 在治疗第3天和第7 天时，模型组、对照组、治疗组TGF-β1的表达量呈逐渐升高趋势，与正常组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，对照组、治疗组TGF-β1 的表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01），与对照组相比，治疗组TGF-β1 的表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。治疗第14 天，各组间TGF-β1 的表达量无明显差异。模型组、对照组、治疗组治疗前后的TGF-β1 表达均呈现先升高后降低的趋势。结果见表3，图3。

表3 4组大鼠疮面肉芽组织TGF-β1 表达变化

图3 4 组大鼠治疗7 天时疮面肉芽组织TGF-β1 的表达（×100）

2.5 肉芽组织Notch1 表达的比较 在治疗第3天时，治疗组Notch1 含量最低，与正常组、模型组、对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），正常组、模型组、对照组Notch1 含量差异无统计学意义（P＞0.05）；在治疗第7 天时，模型组Notch1表达量较正常组低，差异有统计学意义（P＜0.05），正常组、对照组Notch1 表达量较治疗组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗第14 天，各组间Notch1 含量无明显差异。治疗前后模型组、对照组、治疗组的Notch1 表达量大体呈现先降低后升高的趋势。结果见表4，图4。

表4 4组大鼠疮面肉芽组织Notch1 表达变化

图4 4组大鼠治疗3 天大鼠疮面肉芽组织Notch1 表达（×100）

3 讨论

巨噬细胞在疮面愈合、组织修复过程中发挥重要作用。本研究HE 染色显示随着疮面肉芽生长、面积缩小巨噬细胞呈现减少的趋势；造模后炎性细胞增多，随着疮面缩小，成纤维细胞和毛细血管逐渐增多，炎性细胞逐渐减少的趋势，偎脓长肉法治疗组变化较另外两组明显。巨噬细胞在炎性疮面修复过程中，主要通过胞葬作用、表型转换发挥作用，二者相互联系、相互影响。根据活化的方式、细胞表面标志或功能，巨噬细胞可分为Ml 和M2 两个亚群[4-5]。巨噬细胞通过与多种细胞（包括内皮细胞，周细胞和血管平滑肌细胞）相互作用调节血管生成，且在微血管的发生、成熟过程中也发挥重要作用[6-7]。

炎性反应早期，多种介质能够诱导M1 型巨噬细胞比例升高，有利于病原微生物的清除；随着炎性进展，M2 型巨噬细胞逐渐增多，占据主导地位，抑制炎性反应，促进疮面修复。巨噬细胞胞葬作用可抑炎性因子的释放，促进TGF-β、血小板活化因子的表达[4]。胞葬作用异常，导致慢性炎性反应的发生，血管生成相关因子释放减少，造成如慢性难愈性溃疡等。研究显示药物可治疗巨噬细胞胞葬作用及表型转换治疗慢性皮肤溃疡[4-5]，也有学者开展了外用中药对巨噬细胞极化及吞噬功能的研究[8-9]，提示外用中药可通过影响巨噬细胞极化及吞噬功能促进疮面修复。

本研究显示偎脓长肉法通过影响VEGF 和Notch1、TGF-β1 的表达促进疮面内毛细血管的生成和肉芽的生长，进而促进疮面修复。HE 染色显示，偎脓长肉法在大鼠疮面修复早期可减轻炎性反应，在中、后期可促进毛细血管生成和疮面愈合。HE 染色显示肉芽组织内巨噬细胞也呈现在干预早期较多，中、晚期减少的趋势，但是不能确定巨噬细胞的表型。早期研究就揭示偎脓长肉法换药的分泌物内含有大量形态和功能活跃的巨噬细胞，提高巨噬细胞内酶活性促进疮面修复[10-11]，结合本研究结果，推测偎脓长肉法可通过影响巨噬细胞极化，促进肉芽组织内血管生成相关因子的表达，促进疮面愈合。有研究显示：Notch 信号通路可调节巨噬细胞极化，二者间存在相互作用；在调节巨噬细胞生物学功能中发挥关键作用，巨噬细胞的极化与Notch1、Notch2、Notch3 受体的表达呈正相关[12]。

偎脓长肉法促进大鼠慢性皮肤溃疡创面愈合可能与调节肉芽组织内VEGF 和Notch1 的表达有关[3]。Notch 1 是VEGF 的下游信号通路。VEGF激活VEGFR1 和VEGFR2 后，诱导Notch1 及其配体DLL4 的表达，DLL4/Notch 1 的上调能防止新生血管过量芽生，促进功能性血管网的正常构建[13-15]。Notch 信号通路对血管内皮尖端细胞的选择、新生血管形态和功能发育起重要作用，Notch 信号通路与VEGF 通过影响尖端细胞的生物学行为共同调节血管的发生[16]。本研究显示偎脓长肉法治疗组大鼠慢性疮面愈合最快，病理学也显示偎脓长肉法治疗组在早期出现少量毛细血管，7 天时出现丰富毛细血管，14天时溃疡面形成较为成熟的肉芽组织，提示偎脓长肉法可促进疮面毛细血管、成纤维细胞的生成，加速疮面愈合。

本研究免疫组化显示VEGF 和Notch1 的表达趋势为VEGF 高表达时Notch1 低表达，在早中期（3～7 天），随着疮面面积的缩小，组织内VEGF的表达呈现先升高后降低的趋势，而Notch1 在组织内的表达呈现先降低后升高的趋势，巨噬细胞呈现先增多后减少的趋势。偎脓长肉过程中是否存在Notch1 与巨噬细胞的相互作用，仍有待进一步研究。本研究只是初步观察到该趋势，在疮面修复、毛细血管生成过程中巨噬细胞、VEGF 和Notch1信号通路的作用及具体机制仍待深入的研究来揭示。

最近一项应用骨髓间充质干细胞减少多比柔星所致癌症患者的心脏毒性的研究中，骨髓间充质干细胞通过释放VEGF、激活Jagged 1/Notch 1而抑制TGF-β1 的表达[17]，本研究显示VEGF/Notch1 的表达未抑制TGF-β1 的表达，而VEGF/Notch1/TGF-β1 在肿瘤领域及慢性疮面修复中的作用研究较少，仍有待探讨。

综上所述，偎脓长肉法可能是通过调节疮面肉芽组织内VEGF/Notch1/TGF-β1 表达起到促进肉芽生长的作用。偎脓长肉过程中是否存在Notch信号通路与巨噬细胞的相互作用、存在VEGF/Notch1/TGF-β1 相互调节，仍有待深入研究。