银杏叶片黄化过程中光合色素含量和叶绿素荧光参数的变化特征研究

王艺斐，姜泽东，张 敖，计舒文，何梦原，朱延姝

(沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866)

【研究意义】银杏(GinkgobilobaL.)为落叶乔木，是中国北方大量栽培的重要观赏性树木。银杏叶片在秋季低温下变黄，观赏性极高。然而，好景不长，银杏叶片黄化后不久即脱落。这种脱落可能与光抑制引起的衰老有关。【前人研究进展】秋季气温下降，导致植物叶片光合作用中参与暗反应过程的酶活性显著降低，CO2同化速率减慢，而气温降低影响光合作用光反应速率的程度相对较小[1]。光反应与暗反应速率之间的失衡造成激发能过剩，即植株叶片吸收的光能超过CO2同化所能利用的能量。过剩光能引起光抑制，导致叶片光合作用速率持续降低[2]。叶片吸收的过剩光能产生活性氧，后者引起细胞膜脂和蛋白质分子等生物大分子的氧化分解[3]，加快叶片的衰老。【本研究切入点】越冬植物秋季叶片的主要功能是尽可能地维持光合作用，为下一年春天的生长积累营养物质，并且在叶片脱落前维持细胞的基本结构和功能，以利于将叶片中合成的营养物质尽可能多的转移到越冬的延存器官。因此，秋季叶片适当性衰老对多年生树木越冬前的营养物质转移和贮存具有重要意义。在秋季低温胁迫时，控制叶片衰老的关键是清除由光能过剩所导致产生的过多活性氧[4]。银杏叶片在秋季衰老过程中外观颜色显著变红或黄化。研究表明，植物叶片主动延缓衰老的手段是依靠叶片所含光合色素中的类胡萝卜素和花色素来清除产生的活性氧[5-8]。【拟解决的关键问题】本文以3种不同颜色银杏叶片为材料，比较光合色素含量、叶绿素荧光参数和吸收光谱，为了解秋季银杏叶衰老脱落机制及其调控提供研究思路和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

材料选取种植在沈阳农业大学的银杏(GinkgobilobaL.)树，树龄约30年。以向阳且程度一致的无病变、无损伤的绿色叶、浅绿色叶和黄色叶为实验材料，测定叶片的吸收光谱、叶绿素荧光参数及光合色素含量。测定时间为2016年10月上旬，上午，当天平均气温为20 ℃，光照强度为897.867 μmol·m-2·s- 1，5次重复。

1.2 测定指标和方法

1.2.1 吸收光谱测定 银杏叶片吸收光谱的测定使用英国HANSATECH公司的Unispec-SC Spectral Analysis System(PP-Systems)测定银杏3种不同颜色叶片的吸收光谱。

1.2.2 叶绿素荧光动力学曲线测定 使用植物效率仪(Handy PEA，英国HANSATECH公司)测定叶绿素荧光参数。首先用叶夹夹住叶片中部，暗适应时间为30 min。获得的参数包括：Fo(初始荧光minimal fluorescence)、Fm(最大荧光maximal fluorescence)、Fv(可变荧光variable fluorescence，Fv=Fm-Fo)、Fv/Fm(PSⅡ最大光化学效率 optimal/maximal quantum yield of PSⅡ)、Wk(PSⅡ供体侧伤害指数)、ETo/RC(电子传递所需能量)、DIo/RC(反应中心热耗散)和RC/CSm(单位面积反应中心数量)。

1.2.3 光合色素含量测定 参考韦友欢[9]提取光合色素的方法，使用95 %乙醇浸提总色素，测定提取液470、474、485、645、663 nm下的吸光值，计算叶绿素a(Chla)、b(Chlb)、叶绿素a+b(Chla+Chlb)、胡萝卜素和叶黄素含量。

计算公式为：叶绿素a浓度(mg/L)=(9.784×OD663-0.99×OD645)；叶绿素b浓度(mg/L)=(12.6×OD645-4.65×OD663)；叶绿素a含量(mg/g)=叶绿素a浓度(mg/L)×提取液总体积(L)/样品鲜重(g)；叶绿素b含量(mg/g)=叶绿素b浓度(mg/L)×提取液总体积(L)/样品鲜重(g)；胡萝卜素(mg/g)=(12.6OD485-6.00OD470-0.0298a+0.336b) ×提取液总体积(L)/样品鲜重(g)(公式中的a为叶绿素a浓度，b为叶绿素b浓度，下同)；类胡萝卜素(mg/g)=(4.92OD474-0.0255a-0.225b) ×提取液总体积(L)/样品鲜重(g)；叶黄素(mg/g)=(10.2OD470-11.5OD485-0.0036a-0.652b)×提取液总体积(L)/样品鲜重(g)。

1.3 数据分析

采用SPSS 17.0软件分析银杏3种颜色叶片的荧光参数和吸收光谱数据，采用Microsoft Office Excel 2016绘制数据图。

2 结果与分析

2.1 银杏叶片黄化过程光合色素含量比较

表1显示，银杏3种颜色叶片光合色素含量存在差异。绿色叶、浅绿色叶和黄叶的叶绿素a+b、叶绿素a和叶绿素b含量依次降低，均达到显著水平，且与它们的外观颜色表现一致；同时，随着银杏叶片变黄，类胡萝卜素含量与叶绿素a+b含量变化趋势为均逐渐降低，达到极显著水平，但类胡萝卜素含量下降幅度小于叶绿素含量下降的幅度；叶绿素a+b/类胡萝卜素值下降且差异达极显著水平，说明类胡萝卜素的含量相对增加；银杏叶片中胡萝卜素和叶黄素的含量随着叶片颜色由绿色到黄色过程中均逐渐降低，其差异达到极显著水平。随着叶片黄化，叶绿素a+b/总色素值降低，而类胡萝卜素/总色素、胡萝卜素/总色素和叶黄素/总色素值却均升高。这表明尽管银杏叶片黄化过程中总色素及各组分色素均发生降解，呈现下降趋势，但类胡萝卜素、胡萝卜素和叶黄素相对含量呈现上升趋势。银杏叶片衰老过程中，叶黄素/类胡萝卜素相对比值上升。

表1 银杏3种不同颜色叶片的光合色素含量和比值

2.2 3种颜色银杏叶片吸收光谱比较

如图1所示，银杏3种颜色叶片吸收光谱存在明显差异。由于不同种光合色素对可见光的吸收范围不同，导致3种颜色叶片的吸收光谱相差明显。在波长400～510 nm范围内，银杏3种颜色叶片对光能的吸收数量从高到低依次为绿色叶>浅绿色叶>黄色叶；在波长为510～710 nm范围内，浅绿色叶片的光能吸收显著低于绿色叶片，黄色叶片的光能吸收又显著低于浅绿色叶片；在波长为710～1110 nm范围内，不同颜色叶片的吸收光谱几乎重合。植物光合作用中行使吸收光能功能的主要色素是叶绿素，随着叶片的黄化，这种色素的含量显著降低。尽管叶绿素在可见光的短波长的蓝紫光区和长波长的红光区都有吸收峰，但是在本实验中，叶绿素含量降低对3种颜色银杏叶片在长波区的光吸收的影响更大。

图1 银杏3种颜色叶片的吸收光谱比较Fig.1 Comparison absorption spectrum with three types leaves of Ginkgo biloba L.

2.3 3种颜色银杏叶片叶绿素荧光动力学曲线和荧光参数比较

如图2所示，3种颜色银杏叶片叶绿素荧光动力学曲线存在显著差异。绿叶和浅绿叶片的O-J-I-P各点明显，为典型的叶绿素荧光诱导动力学曲线；黄叶的叶绿素荧光动力学曲线未呈现经典曲线特征，O-J-I-P各点不明显，表明黄色叶片的光化学活性处于非常低的水平上。

图2 银杏3种颜色叶片的叶绿素荧光动力学曲线比较Fig.2 Comparison of chlorophyll fluorescence kinetics in three types of leaves with different color of Ginkgo biloba L.

3种颜色银杏叶片叶绿素荧光参数明显不同(表2)。随叶片黄化，最大荧光Fm呈现降低的趋势，黄叶的Fm最低，说明叶片失绿黄化降低叶片PSⅡ的最大光反应活性；与绿叶和浅绿叶的Fv/Fm(PSⅡ最大光化学效率)对比后发现，黄叶Fv/Fm极显著降低，说明黄色叶片具有较强的阻止过剩光能进入叶绿体光能转换系统的能力，从而减少活性氧的产生；与绿叶和浅绿叶相比，黄叶的初始荧光Fo显著降低，但下降幅度远小于Fm和Fv/Fm，说明银杏叶片由绿色转变为黄色的过程中维持有非常强的光能非光化学耗散能力，而且，随着叶片黄化，反应中心的热耗散DIo/RC表现为升高的趋势，这表明黄化叶片的反应中心也形成了较强的能量热耗散能力。Wk(PSⅡ供体侧伤害指数)随着银杏叶片颜色变黄，表现为不断升高的趋势，说明在叶片黄化过程中PSⅡ供体侧伤害程度逐渐加深。

随着银杏叶片的黄化，ETo/RC呈降低的趋势，黄色叶与绿色叶呈现极显著的差异，说明随着叶片黄化光反应复合体吸收的用于电子传递的能量比例也在减少。RC/CSm的趋势呈绿色叶>浅绿色叶>黄色叶，且3种颜色叶片的差异均达到极显著，这样的结果表明单位面积的反应中心数量减少是叶片黄化过程的一个重要特征。

3 讨 论

在本研究中，银杏叶片衰老过程中所有光合色素含量均下降，但是不同光合色素下降的速率存在很大差异，其中叶绿素b下降慢于叶绿素a，类胡萝卜素慢于叶绿素，叶黄素慢于胡萝卜素，从而导致在衰老过程中，叶片的叶绿素a/叶绿素b、叶绿素/类胡萝卜素、胡萝卜素/叶黄素比值下降(表1)。本研究结果显示3种叶色银杏叶片的吸收光谱有显著差异(图1)。在总体上，叶色越黄，可见光的吸收越少。在波长为310～510 nm范围，3种叶片的光吸收差异较小，但在510～710 nm范围，3种叶片光吸收量的差异非常清晰，在750～1110 nm范围内，3种叶片又有相近的光吸收。本研究还观察到随着叶片黄化，Fv/Fm(PSⅡ最大光化学反应效率)的变化与叶绿素含量的变化趋向一致，均为显著下降(表2)，其他叶绿素荧光参数也发生明显变化。

叶绿素是植物光合作用的关键色素，其中一小部分叶绿素a是反应中心色素，将光能转化为化学能。在本研究中，随着银杏叶片黄化，叶绿素—主要是叶绿素a数量减少，导致植物光能转化为化学能的能力降低[10-11]，叶片吸收的光能大部分成为无效吸收，从而导致光系统Ⅱ最大光化学反应效率下降。这种变化与叶片黄化过程中光合速率的下降[12-13]相协调，这样，可以防止激发能过剩而导致的活性氧产生，从而避免或减轻叶片的光氧化破坏。因此，当环境温度较低叶片光合作用下降时，适当加快银杏叶片失绿黄化可能有助于减缓衰老，从而推迟脱落，延长观赏期。

类胡萝卜素是光合作用中的辅助色素，但不可缺少，其作用之一是将吸收的光能传递给叶绿素，其二是保护作用，将过剩激发能以热能的形式耗散，防止活性氧的产生[14-15]。在本研究中，在银杏叶片衰老过程中所有光合色素含量都呈下降趋势，但是类胡萝卜素尤其是叶黄素的比例上升。这一结果也与杨舜博在银杏金叶呈色的调控机理研究结果相同，该实验鉴定出银杏叶片黄化过程中调控类胡萝卜素生物合成的关键基因ZDS、LCYE等均上调表达，同时KEGG分析中发现类胡萝卜素生物合成通路存在富集现象，皆促进黄色叶片中类胡萝卜素不断积累[16]。说明在叶片衰老阶段仍会产生大量过剩激发能，有较多的活性氧产生，需要类胡萝卜素来清除。业已证明，叶黄素循环是叶片过剩激发能热耗散的重要途径之一[17-18]。因此，在秋季温度降低时，适当维持叶片类胡萝卜素含量将有助于延缓衰老脱落。

光系统Ⅱ最大光化学反应效率是表示植物光反应能力的重要参数，植物在受到光抑制时导致Fv/Fm下降[19]。有研究者发现光胁迫导致PSⅡ中的D1蛋白降解，造成电子受体锐减，也会影响光合机构功能，导致光能转化率降低[20-22]。在本研究中，浅绿叶与绿叶相比，Fv/Fm的下降幅度较小，而黄叶与绿叶和浅绿叶相比，Fv/Fm的下降幅度均很剧烈。然而，比较不同叶片的PSⅡ最大荧光Fm(表2)发现，该参数在不同叶片之间的差异远大于Fv/Fm的差异。与绿叶相比，浅绿叶的Fm下降幅度远大于Fv/Fm的下降，说明Fv/Fm不能很好的反映叶片衰老过程中光反应的实际变化，因为它只说明了PSⅡ反应中心的光化学反应效率，不能反映叶片总体PSⅡ活性的变化情况。在叶片衰老过程中，不仅单个光系统的活性发生变化，而且，活性光系统总数也发生变化。浅绿叶和黄色叶的RC/CSm(单位面积活性反应中心数量)均显著低于绿色叶片。这暗示我们在用Fv/Fm衡量衰老叶片的光化学变化时，需要参考Fm和RC/CSm的变化。

4 结 论

本研究发现一个难以解释的现象，即尽管3种颜色银杏叶片的光合色素含量有较大差异，但在310～500和750～1110 nm波长范围内，3种叶片光能吸收量的差异较小，与光合色素含量变化幅度不一致。这种现象尚未见合理的解释。我们推测这可能与色素蛋白复合体结构变化有关。在衰老进程中，银杏叶片色素蛋白复合体解体，色素分散，有利于吸收光能。因此，尽管在黄化叶片中光合色素含量较低，但仍能吸收较多的光能。黄化叶片的这种特性可能有利于其在白天提高叶片温度，有助于叶片内含物的分解和向外转运。不过，这个特性可能引起叶片衰老脱落加快，不利于其观赏期的维持。