维生素D受体基因多态性及儿童免疫力的相关性研究

高卫安 黄烈平 吴金华

[摘要] 目的 探討儿童免疫力与维生素D受体基因（Vitamin D receptor，VDR）的相关性，揭示VDR基因多态性和儿童免疫力的相关性，并研究其在免疫力低下发生发展中的作用机制。 方法 选取2018年1月～2020年1月在我院进行检查的0～14岁儿童80例，根据T淋巴细胞亚群检测，将儿童分为研究组（免疫力低下）和对照组（健康），每组各40例。收集各组儿童的年龄、身高等临床资料及外周血标本，运用化学发光法检测其血清中维生素D（VD）的浓度。设计引物用位点阻滞法，进行VDR多态性位点Apa I、Bsm I、Taq I、Fok I的检测。 结果 两组VDR多态性位点Bsm I、Taq I、Fok I基因型比较，差异无统计学意义（P>0.05）;两组Apa I基因型的分布比较，差异有统计学意义（P<0.01）。研究组外周血清中25-OH VD水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。研究组感冒次数多于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且感冒次数与VD水平呈负相关。 结论 Apa Ⅰ基因多态性可能在免疫力低下的发病机制中发挥作用，Bsm I、Taq I、Fok I基因多态性则与其无关。研究组VD水平低于对照组，提示血清VD水平可能对免疫力有增强作用。

[关键词] 维生素D受体;基因多态性;儿童;免疫力

[中图分类号] R729          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）32-0015-05

[Abstract] Objective To explore the correlation between child immunity and vitamin D receptor gene（vitamin D receptor， VDR）， to reveal the correlation between VDR gene polymorphism and child immunity， and to study its mechanism in development in the development of low immunity. Methods A total of 80 children aged 0-14 were selected from January 2018 to January 2020 in our hospital， according to the detection of T lymphocyte subsets， they were divided into research group（immunocompromised） and control group（healthy） with 40 children in each group. And the clinical data such as age and height， and the peripheral blood samples of children were collected. The concentration of vitamin D（VD） in serum was detected using chemiluminescence method. The VDR polymorphism sites Apa I， Bsm I， Taq I， Fok I were detected by site block method for primer design. Results There were no significant differences in the Bsm I， Taq I and Fok I genotypes of VDR polymorphism sites between the study group and the control group（P>0.05）. The distribution of Apa I genotype in the two groups was statistically different（P<0.01）. The 25-OH VD level in the peripheral serum of the study group was lower than that of the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of colds in the study group was higher than that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of colds and VD levels had a negative correlation trend. Conclusion The polymorphism of Apa I gene may play a role in the pathogenesis of immunocompromise， but the polymorphism of Bsm I， Taq I， and Fok I genes has nothing to do with it. The level of VD in the study group was lower than that in the control group， suggesting that the level of serum VD may enhance immunity.

[Key words] Vitamin D receptor; Gene polymorphism; Children; Immunity

维生素D（Vitamin D，VD）是一种拥有广泛生理功能的激素和营养素，不仅影响钙磷代谢和骨组织矿化，还与糖尿病、心血管疾病、免疫性疾病及肿瘤等密切相关[1]。大量流行病学研究显示，VD缺乏在儿童中普遍发生，30%～40%的儿童存在不同程度的VD缺乏[2-6]。这不仅影响儿童的生长发育，且可能影响其未来的健康状况。免疫力是儿童抵御疾病的基本能力，免疫是维持机体免受感染性疾病感染的稳定状态，它是一套复杂的生理机制，可让机体识别、中和、消除异物。其中T淋巴细胞亚群在机体免疫调节中发挥重要作用，CD4+具有增强吞噬细胞的抗感染免疫功能，CD3+为外周血成熟T细胞，其浓度的降低提示T细胞免疫功能低下。CD8+在细胞调节及免疫功能中具有抑制作用。CD4+/CD8+比值是反映机体免疫系统内环境稳定的一个重要指标，CD4+/CD8+比值降低提示机体免疫功能受到抑制，以此作为免疫功能的检测标准。

学龄前是儿童生长发育的关键时期，该时期的儿童免疫功能差，易发生疾病，而感染是儿童发病和死亡的主要原因[7-8]。多项研究表明，VD可提高儿童自身免疫功能，减少微生物病原体的感染[9-13]。呼吸系统是儿童最易受到侵犯的系统，江笑文[14]发现，反复呼吸道感染患儿存在严重的VD缺乏和免疫力低下的情况，表明VD缺乏可能会导致细胞免疫功能异常，从而增加呼吸道反复感染的风险。李微娜等[15]对呼吸道反复感染的患儿采用VD联合治疗，结果显示VD可有效改善患儿的临床症状，减少感染次数。进一步研究发现，VD可以通过多种机制影响感染的易感性和严重程度，它通过影响抗菌肽Cathelicidin的产生[16-17]，增加机体对病毒和细菌的敏感性，并通过特异性和非特异性免疫系统及NF-κB途径影响感染过程中的细胞因子谱。VD的作用由胞质维生素D受体（VDR）介导，25-羟维生素D3经肝肾代谢产生后结合VDR，进入细胞核，作为配体激活的转录因子并激活基因表达。VDR基因位于12q13.1号染色体上，具有多个多态性区域，其中一些与某些疾病的易感性有关[18]。这意味着VD敏感性存在巨大的个体间差异，且VD缺乏还会导致患病风险增加。因此，本研究通过探讨儿童免疫力低下与VD水平及VDR基因多态性表达的相关性，以揭示VD在免疫力低下发生发展中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月～2020年1月在我院进行系统保健和正常体检的宁波地区0～14岁儿童80例作为研究对象。纳入标准：根据T淋巴细胞亚群检测[19]的正常值参考范围[CD4+：（410～1590）/μL，CD8+：（190～1140）/μL]，将儿童分为研究组（免疫力低下）和对照组（健康），每组各40例。采集两组儿童的外周血标本，并收集其年龄、身高等临床资料。研究组中，男22例，女18例;平均年龄（6.41±2.02）岁。对照组中，男21例，女19例;平均年龄（6.03±1.89）岁。两组的性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。排除标准[20]：排除合并心、肝、肾等器质性病变或恶性肿瘤者、合并免疫相关疾病者及入组前有服用VD补充剂史的儿童。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

1.2 方法与观察指标

所有的实验均单独重复3次。采用全血DNA小量试剂盒（3001250，杭州新景生物）、总VD测定试剂盒（化学发光法）、NovoStartR SYBR qPCR SuperMix Plus（E096，上海近岸蛋白）、7500 FAST实时荧光PCR仪进行检测，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。见表1。

1.2.1全血DNA提取  采集各组患儿外周血标本，分装于EDTA-K2抗凝管和普通干燥管中，使用全血DNA小量试剂盒，按照说明书进行全血DNA提取。并利用微量分光光度计对其浓度及纯度进行检测。

1.2.2 qPCR基因分型  將提取的DNA作为扩增反应模板，加入NovoStartR SYBR qPCR SuperMix Plus和相应的引物，采用传统的三步法对VDR SNPs进行实时PCR分型。每例DNA模板同时在两个反应管中进行，分别用引物对上游引物/野生型下游引物和引物对上游引物/突变型下游引物进行扩增，设置3个复孔，利用扩增阻滞突变系统法进行基因分型。

1.2.3 25-羟维生素D3水平检测  检测血清25-羟维生素D3水平，采用总VD体外诊断免疫试剂盒测定分析，利用ADVIA Centaur全自动化学发光免疫分析仪，确定VD水平。

1.2.4 T淋巴细胞亚群检测  使用流式细胞仪对T淋巴细胞亚群水平进行测定，T淋巴细胞亚群检测项目包括CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+。

1.3 统计学分析

数据应用SPSS22.0统计学软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，采用t检验;计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VDR多态性位点检测方法可行性

通过前期实验验证，以VDR基因的rs2228570、rs1544410、rs7975232三个SNP位点的突变碱基，利用所设计的特异性引物对全血DNA进行SNP位点特异性扩增，根据7500 FAST实时荧光PCR仪的分析结果得到基因型，与测序结果比对后发现，11个样本采用实时荧光定量PCR方法基因分型结果与测序结果均一致。证明该方法特异性高、重复性高，操作方便快捷，可以为本研究提供检测技术支持。

2.2两组VDR多态性位点比较

2.2.1 两组Bsm I检测结果比较  Bsm I（rs1544410）基因序列的野生基因型为GG，突变基因型为AG和AA，研究组和对照组均未检测到另一突变基因型AA。两个不同分组基因频率分布经Hardy-Weinberg平衡定律（H-W test）检测，显示均符合H-W分布（P>0.05）。检测到的基因型GG和AG在两组中的分布比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2.2 两组Fok I检测结果比较  Fok I（rs2228570）基因序列的野生基因型为CC，突变基因型是CT、TT，符合H-W分布（P>0.05）。此三种基因型在研究组和对照组中的分布比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.2.3 两组Taq I检测结果比较  Taq I（rs731236）基因序列的野生基因型为TT，突变基因型为CT和CC，研究组与对照组均未检测到突变型基因CC，符合H-W分布（P>0.05）。基因型TT、CT在两组中的分布比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.2.4 两组Apa I检测结果比较  Apa I（rs7975232）基因序列的野生基因型为CC，突变基因型为CA、AA，符合H-W分布（P>0.05）。三种基因型在两组的分布比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5。

2.2.5 两组外周血清中25-羟维生素D3水平比较  研究组25-羟维生素D3水平为（45.51±5.20）nmol/L，低于对照组的（60.25±4.60）nmol/L，差异有统计学意义（P<0.01）。见表6、图1。

2.2.6 两组VD水平与临床特征相关性  研究组近一年感冒次数为（10.12±2.30）次，高于对照组的（4.07±1.30）次，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。感冒次数与25-羟维生素D3水平呈负相关，即血清中25-羟维生素D3水平越高，感冒次数越少。见图3。

3讨论

先天免疫力是病原体入侵之后人体的第一道防线，其中最重要的是先天免疫细胞。当出现诸如昆虫叮咬等微环境损伤时，最先出现的是中性粒细胞和巨噬细胞。它们分泌具有高度破坏性的物质，包括各种活性酶和化学成分，吞噬并消化受损的物质。当两种细胞的作用未奏效时，感染就引起了淋巴细胞的注意，淋巴细胞具有特异性识别和记忆功能，使免疫系统能够做出更多的反应并记住各种感染类型，从而以更快、更有效的反击来应对再次感染，这些响应都依赖于特定基因的选择性表达。

VD对人体的免疫系统有重要影响，其既可以调节先天免疫和适应性免疫，还可以调节炎症级联反应。一项汇集11 321名参与者的Meta分析显示，补充VD可降低受试者急性呼吸道感染的风险，且对VD缺乏患者受益最大[19]，Bergman等[20]汇总了11项随机安慰剂对照试验，共涉及5660人（平均年龄16岁，6个月～75岁），分析结果显示，补充VD可显著降低呼吸道感染的風险（P<0.01）。已有的研究显示，反复呼吸道感染患儿存在25-羟维生素D3和免疫球蛋白功能降低的情况，补充VD后，患儿机体免疫力显著提高，呼吸道感染的发生率显著降低[21]。本研究通过位点阻滞法进行分析，结果显示，Apa I基因三种基因型在实验与对照组中的分布比较，差异有统计学意义（P<0.05），Apa I基因的野生基因型（CC）相比突变基因型（CA、AA）有更好的抗病能力（P<0.05），而与Bsm I、Taq I、Fok I基因的多态性无关。孙越等[22]的研究显示，Apa I突变型基因人群中，血清免疫球蛋白水平显著低于正常非突变人群，验证了该基因型对免疫力的影响。

VD与免疫系统之间存在多种相互作用，大多数免疫细胞在自身受刺激后可表达VDR。研究显示，VD调节炎症和免疫力的机制似乎是多方面的，其可以调控巨噬细胞和树突状细胞的活性，以及中性粒细胞中各种Toll样受体介导的信号通路。本研究显示，研究组25-羟维生素D3水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），并且研究对象的感冒次数与25-羟维生素D3水平呈负相关，即VD在一定程度上能够增强儿童免疫力。VDR分布于各种组织中，VD调控机制具有多样性及重要性。但是目前的研究尚未明确VD的补充标准，根据实验结果，需要结合VDR基因多态性及进一步的临床试验以确定最合适的补充方案，以此判断VD缺乏的原因及用什么方式改善这种状况。

综上所述，VDR基因多态性与儿童免疫力具有相关性，其相关基因为Apa I，野生型的免疫力高于突变型，并且VD可能具有与儿童感染风险相关的免疫调节功能，血清中VD含量与感冒次数呈负相关。

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（收稿日期：2020-07-23）