Hedgehog通路在缺氧诱导脑胶质瘤转移中的作用及分子机制研究

傅之梅 胡兵伟 王钱东 马婷婷

[摘要] 目的 探討Hedgehog通路在缺氧诱导脑胶质瘤转移中的作用及分子机制。 方法 选择2018年1月～2019年8月浙江省立同德医院脑胶质瘤患者5例，取其脑胶质瘤细胞，随机分为对照组、抑制剂处理组、乏氧组和乏氧加抑制剂处理组。各组细胞均完成48 h培养，采用Westernblot检测各组细胞Smoothened（SMO）、神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1（GLI1）和上皮间质转化（EMT）E-cadherin基因表达，采用BrdU-ELISA法检测细胞增殖，采用Transwell法检测细胞侵袭作用。 结果 Westernblot检测结果显示，乏氧加抑制剂处理组SMO、GLI1及EMT相关蛋白表达水平低于乏氧组、抑制剂处理组与对照组（P<0.05）;乏氧组SMO、GLI1及EMT相关蛋白表达水平高于抑制剂处理组与对照组（P<0.05）。BrdU-ELISA法结果显示，乏氧加抑制剂处理组不同时间点细胞增殖率低于乏氧组，高于抑制剂处理组与对照组（P<0.05）。Transwell法检测结果显示，乏氧加抑制剂处理组细胞侵袭率低于乏氧组，但明显高于抑制剂处理组与对照组（P<0.05）;乏氧组细胞侵袭率高于抑制剂处理组与对照组（P<0.05）。 结论 Hedgehog通路可能通过SMO、GLI1调控EMT，参与疾病的发生、发展，在缺氧诱导脑胶质瘤转移中发挥重要的作用，能为脑胶质瘤转移治疗提供新的靶点。

[关键词] Hedgehog通路;Smoothened;神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1;上皮间质转化;缺氧诱导;脑胶质瘤转移

[中图分类号] R739.41          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）32-0020-04

[Abstract] Objective To explore the role and molecular mechanism of Hedgehog pathway in hypoxia-induced glioma metastasis. Methods From January 2018 to August 2019， a total of 5 patients with glioma from Tongde Hospital of Zhejiang Province were selected as subjects. Glioma cells were collected and randomly divided into a control group， an inhibitor-treated group， a hypoxia group， and a hypoxia combined with inhibitor-treated group. The cells in each group were given 48 hours of culture. The expression of Smoothened（SMO）， glioma-associated oncogene homologous protein 1（GLI1） and epithelial mesenchymal transformation（EMT） E-cadherin genes were detected by Westernblot， cell proliferation was detected by BrdU-ELISA method， and cell invasion was detected by Transwell method. Results Westernblot test results showed that the expression levels of SMO， GLI1 and EMT-related proteins in the hypoxia combined with inhibitor-treated group were lower than those in the hypoxia group， inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; the expression levels of SMO， GLI1 and EMT-related proteins in the hypoxia group were higher than those in the inhibitor-treated group and the control group（P<0.05）; the results of BrdU-ELISA showed that the cell proliferation rate in the hypoxia combined with inhibitor-treated group at different time points was lower than that in the hypoxia group， but was higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; Transwell test results showed that the cell invasion rate in the hypoxia combined with inhibitor-treated group was lower than that in the hypoxia group， but was significantly higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; the cell invasion rate in the hypoxia group was higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）. Conclusion Hedgehog pathway may participate in the occurrence and development of EMT through SMO and GLI1 regulations， which play important roles in hypoxia-induced glioma metastasis and can provide a new target for the treatment of glioma metastasis.

[Key words] Hedgehog pathway; Smoothened; Glioma-associated oncogene homologous protein 1; Epithelial mesenchymal transformation; Hypoxia-induced; Glioma metastasis

胶质瘤是临床常见的恶性肿瘤，在中枢神经系统肿瘤中较为常见，占颅脑肿瘤的35.26%～60.96%，其发病率占脑肿瘤首位，死亡率居第二位[1]。由于胶质瘤具有高浸润生长的生物学特性，导致手术无法保证肿瘤的完全切除，术后复发率近90.0%，且随着手术次数、复发次数的增加，恶性程度具有增加趋势。缺氧是肿瘤微环境的基本特征之一，能促进肿瘤侵袭和转移作用[2-3]。临床研究显示，介导缺氧应答的主要转录因子-缺氧诱导因子1α（HIF-α）在脑胶质瘤等多种肿瘤中过表达，且与脑胶质瘤的转移、预后有关[4-5]。上皮间质转化（EMT）是将具有极性的上皮细胞转换成具有活性能力、能在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程[6]。Suh[7]的研究表明，Hedgehog通路中的锌指转录因子GLI1及上游转膜蛋白SMO亦是上述缺氧/JDAC3调节的靶基因，哺乳动物Hedgehog通路由三种HH配体激发，能与受体转膜蛋白Patched1（PTCH1）结合，从而阻断PTCH1对转膜蛋白SMO的抑制功能，释放SMO活性，实现下游靶基因的调控作用[8-9]。因此，本研究以脑胶质瘤细胞为研究对象，探讨Hedgehog通路在缺氧诱导脑胶质瘤转移中的作用及分子机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月～2019年8月浙江省立同德医院脑胶质瘤患者5例。取其脑胶质瘤细胞，随机均分为对照组、抑制剂处理组、乏氧组和乏氧加抑制剂处理组。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 材料与设备  胎牛血清RMPI-1640培养基（美国HyClone公司）、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、Transwell小室（美国Becton Dickinson）、人工基质胶Mateigel（美国Becton Dickinson）、青/链霉素，RIPA裂解液、BCA法蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司）。

1.2.2 细胞处理[10-11]  取脑胶质瘤细胞，将细胞接种在浓度为10.0%的胎牛血清RMPI-1640培养基中，放置在37℃、浓度为5%的CO2细胞培养箱中培养，待细胞融合80.0%以上时，开始传代培养。培养前去除原培养液，并利用PBS缓冲液连续进行2次漂洗。向获得的溶液中加入浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液进行消化，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞回缩、变圆后，将消化液吸出，并加入完全培养液终止消化。利用吸管反复、轻柔吹打培养瓶底，使细胞充分脱离瓶壁。取细胞悬液15 mL放置在离心管中，连续进行8 min离心，离心速度1000 rpm，去除上清液;向获得的细胞悬液中加入完全培养基重悬细胞，以1∶2进行传代培养，每3天换液一次，待细胞融合90.0%时再次传代，取第三代对数生长的细胞，将其随机分装在不同的试管中进行分组。对照组不采取任何措施处理及干预，向细胞中加入培养基进行常规培养，连续完成48 h培养;抑制剂处理组在常规培养24 h后加入SANT1、GANT61处理48 h;乏氧组在收细胞前24 h由常规培养改为低氧（1%O2）培养，连续完成48 h培养;乏氧加抑制剂处理组在低氧培养24 h后加抑制剂处理48 h。各组细胞处理后放置在培养箱中进行培养，培养箱为37℃、5%CO2、饱和湿度[12]。

1.2.3 检测方法  （1）典型基因标志表达：采用Western blot检测各组细胞Smoothened（SMO）、神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1（GLI1）和上皮间质转化（EMT）标志蛋白E-cadherin表达[13]。具体步骤包括：①蛋白质的提取;②蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳;③蛋白质转印;④封闭;⑤一抗、二抗孵育;⑥显影。将最终处理后的PVDF膜，以β-actin作为内参物，根据正确的位置、方法放置在发光板（蛋白面板）上，并加入少许发光液，选择合适的曝光条件，完成显影并保存。（2）细胞增殖：采用BrdU-ELISA法检测细胞增殖。取各组干预后12、24、36及48 h的细胞，以20 000/孔培养在96孔细胞培养板中，以梯度浓度CWE完成72 h处理，根据BrdU试剂盒说明，完成细胞的固定、冲洗，加入相应的抗体、洗涤后显色，在微孔板分光光度计上以450 nm波长度数进行测定[14]。（3）细胞侵袭能力：采用Transwell法检测细胞侵袭能力。取各组干预后的细胞，以1×105个/孔的密度接种在24孔板Transwell中，每孔中设置复孔5个，并且在上室加入200 μL DMEM∶F12培养基、下室加入600 μL DMEM∶F12培养基，并在37℃细胞培养箱中连续完成48 h培养，吸取下室中培养液，加入结晶紫染色液100 μL/孔，连续完成10 min染色，染色完毕后采用PBS进行2次洗涤，400倍显微镜下連续统计5个视野的细胞并取平均值[15]。

1.3观察指标

①典型基因表达：记录乏氧加抑制剂处理组、乏氧组、抑制剂处理组、对照组各典型基因的表达水平。②增殖率：记录各组干预后12、24、36及48 h的细胞增殖率。③细胞侵袭率：记录各组细胞干预后12 h的细胞侵袭率。

1.4 统计学分析

数据应用SPSS22.0统计学软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，采用t检验;计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组典型基因标志表达比较

Westernblot检测结果显示，乏氧加抑制剂处理组SMO、GLI1及EMT相关蛋白E-cadherin表达水平分别为（0.32±0.05）、（0.41±0.08）、（0.35±0.06），低于乏氧组的（0.78±0.12）、（0.80±0.14）、（0.79±0.13），低于抑制剂处理组的（0.57±0.11）、（0.62±0.14）、（0.59±0.12），低于对照组的（0.60±0.13）、（0.69±0.16）、（0.67±0.15），差异有统计学意义（P<0.05）;乏氧组SMO、GLI1及EMT相关蛋白E-cadherin表达水平高于抑制剂处理组与对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

2.2 各组细胞增殖率比较

BrdU-ELISA法结果显示，乏氧加抑制剂处理组不同时间点细胞增殖率低于乏氧组，高于抑制剂处理组与对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;乏氧组不同时间点细胞增殖率高于抑制剂处理组与对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3各组细胞侵袭率比较

Transwell法检测结果显示，乏氧加抑制剂处理组细胞侵袭率为（58.56±5.67）%，低于乏氧组的（78.57±6.83）%，但明显高于抑制剂处理组的（27.58±5.31）%与对照组的（37.59±7.21）%，差异有统计学意义（P<0.05）;乏氧组细胞侵袭指数高于抑制剂处理组与对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

脑胶质瘤是由大脑和脊髓胶质细胞癌变产生的、最常见的原发性颅脑恶性肿瘤，其发病率占颅内肿瘤的35.2%～61.0%，主要由胶质细胞演化而来，具有发病率高、复发率高及死亡率高等特点，影响患者的健康和生活。缺氧是脑胶质瘤转移的基本特征，持续的缺氧能促进肿瘤侵袭与转移[16]。而介导缺氧应答的主要转录因子在脑胶质瘤中呈高表达，其表达水平与脑胶质瘤的转移、预后存在相关性[17]。目前，临床对于脑胶质瘤的病因尚未明确，可能与肿瘤本身存在紧密联系，其中主要包括病毒感染、化学、电磁辐射及环境等因素。临床研究显示，HIF-1α/HIF-1β转录复合体的稳定与活化激活下游靶基因，调控脑胶质瘤细胞的增殖、血管生成及上皮间质转化（EMT），能促进肿瘤的转移[18]。本研究中Westernblot检测结果显示，乏氧加抑制剂处理组SMO、GLI1及EMT相关蛋白E-cadherin表达水平低于乏氧组、抑制剂处理组与对照组（P<0.05），乏氧组SMO、GLI1及EMT相关蛋白E-cadherin表达水平高于抑制剂处理组与对照组（P<0.05），说明Hedgehog通路在脑胶质瘤转移中呈高表达，且乏氧状态下肿瘤转移率最高，能加剧肿瘤的转移。Hedgehog通路最早在研究果蝇基因突变时被发现，在脊椎动物中其信号通路成员较多，如膜受体Ptch、配体Hh、Smo及下游转录因子Gli。当配体处于功能状态时，Shh、Ptch结合接触，能抑制Smo受体，从而引起下游转录因子激活，能促进细胞的增殖激活。而当配体处于无功能状态时，Ptch对受体能发挥良好的抑制作用，引起Gli发生水解、失效。因此，激活Hh对配体的发育具有重要的作用。本研究中BrdU-ELISA法的结果显示，乏氧加抑制剂处理组不同时间点细胞增殖率低于乏氧组，高于抑制剂处理组与对照组（P<0.05），说明乏氧能促进脑胶质瘤细胞的增殖，而给予细胞抑制剂，则能在一定程度上抑制细胞的增殖。杨宁等[19]的研究结果显示，N-Shh能刺激脑胶质瘤细胞的侵袭、转移，而Hh信号通路特异性阻断剂的干预可降低细胞的侵袭和转移。本研究中Transwell法检测结果显示，乏氧加抑制剂处理组细胞侵袭率低于乏氧组，但明显高于抑制剂处理组与对照组（P<0.05），乏氧组细胞侵袭率高于抑制剂处理组与对照组（P<0.05），说明乏氧加抑制剂处理能降低脑胶质细胞的侵袭和转移，而乏氧则能促进脑胶质细胞的侵袭。姚军利等[20]的研究显示，阻断Hh信号通路能抑制脑胶质瘤细胞的侵袭，可能与Glil抑制血管内皮生长因子的表达有关，从而抑制肿瘤的侵袭和转移。

综上所述，Hedgehog通路可能通过SMO、GLI1调控EMT，参与疾病的發生、发展，在缺氧诱导脑胶质瘤转移中发挥重要的作用，能为脑胶质瘤转移治疗提供新的靶点。

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（收稿日期：2019-12-09）