p53 突变与结肠癌的研究进展

刘 菲 刘 展

（1.湖南师范大学附属第一医院（湖南省人民医院） 消化内科，湖南 长沙 410000；2.岳阳职业技术学院 基础医学部，湖南 岳阳 414000）

结肠癌是常见的消化道肿瘤之一，也是导致人类死亡的主要原因之一。流行病学研究显示，因结肠癌和/或结肠癌相关并发症导致的死亡约占所有肿瘤致死人数的10%左右[1]。预计到2035年，全球将新增250 万结肠癌患者[2]。在50 岁以下人群中，结肠癌发生率逐年增加，以直肠癌和左侧结肠癌常见。尽管遗传、生活方式改变、肥胖和环境因素可能与结肠癌发生有关，但导致结肠癌发生率显著增长的原因仍不明确。

研究显示，抑癌或促癌基因发生突变后不断积累会导致结肠癌的发生和恶性进展。TP53/Trp53（人/小鼠p53 基因）编码的抑癌基因p53在多种肿瘤发生和发展中具有重要的作用。p53除了具有抑癌作用之外，当p53 在DNA 绑定结构域发生错义突变时，p53 会突变成促癌基因。但值得注意的是，p53 突变成促癌基因有以下两种方式，一种是错义突变的过程中发生原有野生型p53 功能的缺失，另外一种错义突变的发生增加了具有促癌功能的基因。近年来的临床和基础研究显示，p53 的错义突变在肿瘤的发生和发展的作用十分复杂，本文就近几年来p53 突变（包括获得致癌性突变和丢失野生型功能突变）在结肠癌中作用的临床和基础研究结果进行综述。

1 结肠癌的可能发生机制

1.1 结肠癌与突变基因

大部分的结肠癌都从息肉发展而来。通常从肠腺窝异常增生开始，逐渐发展成赘生性的增生（息肉），到最终发展为结肠癌并转移、浸润其他器官，这一过程大致需要10-15 年。而这一过程被称为多步骤的肿瘤发生，在肿瘤发生、发展的过程中每一个步骤都与特定的抑癌基因或促癌基因的突变有关[3]。近年来全基因组关联研究（genome-wide associated studies,GWAS）鉴 定出一些与结肠癌密切相关的突变基因，其中包括APC、KRAS、SMAD4 以 及TP53，这些突变基因与80%左右的结肠癌相关[4]。研究发现，包括APC、KRAS、SMAD4 以及TP53 在内的基因突变与获得干细胞特性、细胞增殖能力增强、分化能力抑制以及DNA 完整性维持能力受损密切相关，而这些改变是肿瘤细胞的特有标志，并且是肿瘤细胞信号通路中关键调控基因[5]。另外，在除结肠癌外的多种肿瘤中，同样也发现了由包括APC、KRAS、SMAD4 以及TP53 在内的基因突变导致的细胞内信号通路改变，提示这些基因发生突变引起的细胞内信号通路改变是关键的促癌信号，与肿瘤的类型无关[6]。

1.2 突变基因与多步骤肿瘤发生

近年来由于正常肠道干细胞培养技术的发展，使得能够在体外培养的条件下模拟体内环境，证实这些突变基因在肿瘤发生和发展中的作用。研究证实在体外培养的正常肠道类器官通过转基因技术诱导结肠癌发生相关的APC、KRAS、SMAD4以及TP53 中的4 个基因或5 个基因发生突变，诱导系膜细胞表型转换，再将这些发生表型转换的类器官移植到正常的小鼠皮下，可以导致结肠癌的发生。这些研究结果进一步证实了多步骤肿瘤发生这一概念，尽管还存在着其他导致肿瘤形成的可能机制存在，例如表观遗传的改变等[7]。

2 p53 突变与人结肠癌

2.1 p53 突变导致结肠癌的可能原因

研究显示p53 种系突变与家族性癌症综合征李-佛美尼综合征（Li-Fraumeni syndrome）密切相关，李-佛美尼综合征是一种伴发多种起源于不同器官癌症的临床综合征，提示p53 在多种癌症等发生中均起着抑癌等作用。与之一致的是，在胰腺癌中p53 突变是最常见的致癌突变，占到所有突变基因的43%[8]。在非高突变型结肠癌中，p53 的突变率大约在55%-60%之间，是这一类型的结肠癌中突变率第2 位的基因，突变率占第1位的是APC 基因，其突变率达到了80%以上，但在高突变型结肠癌中，TP53 的突变率大致在20%左右[9]。

研究显示，p53 发生突变与多种癌症的预后不佳密切相关，这其中就包括结肠癌。研究同时发现，当结肠癌发生转移时，p53 的突变率会增加至80%以上。另外，p53 的突变并不发生在结肠瘤样息肉阶段，在此阶段p53 的突变率大致在15%-30%左右[10]。这些结果提示p53 突变可能在结肠癌的中晚期起着促癌作用，例如从结肠腺瘤到结肠腺癌的转变，以及结肠癌的远端转移。

包括DNA 损伤、端粒酶丢失、低氧以及营养缺乏在内的细胞应激和促癌信号通路的激活、p53活化等会导致细胞周期停滞、衰老和细胞凋亡。而这些细胞应激性反应都受到p53 调控的下游基因调控，例如p53 下游的p21、Tiger、PAI-1 基因。当p53 失去转录活性的时候，会导致这些受到p53 调控的基因过度激活，而这可能是p53 突变导致肿瘤发生的可能原因之一。

2.2 p53 错义突变与结肠癌的发生和发展

研究发现，在肿瘤细胞中约74%左右的TP53突变为错义突变，即在DNA 绑定结构域内发生氨基酸替换，其中替换发生频率最高的氨基酸残基是R175、G245、R248、R249、R273 和R282[11]。在正常情况下，p53 在空间上的结构为一个四聚体，而发生突变后，将破坏这一结果，影响其正常的功能。研究显示，当p53 错义突变发生在小鼠R173H 位点时（人相对应的位点为R175H）会减弱抗癌治疗恢复的野生型p53 的功能[11]。但是，进一步的研究发现，在这些频率最高位点的TP53错义突变导致的促癌作用可能通过获得某些功能所引起，尽管每一个位点发生的错义突变在肿瘤的发生中均有其特定的作用。此外，这些TP53 的错义突变与结肠癌的预后成明显的正相关，提示当p53 发生错义突变获得某些功能时在肿瘤的进展中可能起着重要的作用。需要注意的是，在非高频率突变型结肠癌中，超过80%的肿瘤通过杂合携带p53 错义突变而丧失其原本的野生型功能[12]。综上所述，这些结果提示p53 在最常见的位点发生错义突变导致其获得某些功能，促进结肠腺瘤向结肠腺癌的转变，而额外的杂合错义突变导致的p53 功能丧失在肿瘤发生晚期会导致更恶性的表现。

在小鼠中已经发现两种与肿瘤发生相关的可以获得功能性的p53 错义突变。过表达R172H或R270H 突变（人相对应的位点为R175H 和R273H）的Trp53 转基因小鼠会自发肠道和肺部肿瘤，其机制与p53 在细胞核内聚集相关，但敲除p53 基因不会发生自发性肿瘤。除此之外，还发现了其他一些与p53 错义突变导致肿瘤发生的机制。例如，发现p53 突变通过促进Rub 耦合蛋白与整合素蛋白以及肝生长因子受体结合，导致EGFR/整合素信号通路和肝生长因子信号通路的激活，引起肿瘤细胞侵袭和迁移能力增强[12]。p53 突变还可以通过结合p63 和p73，加速转化生长因子-β（TGF-β）介导的肿瘤转移以及PDGFβ 信号通路。p53 突变增加干细胞池和肠内皮细胞的数量，而这可能导致肿瘤增生能力增强。

近年来，有研究发现p53 突变同样可以通过表观遗传改变介导大量的基因表达异常，这其中包括促癌基因。当p53 发生错义突变时（包括发生在R175H 和R273H 的错义突变），可以通过与SWI/SN 染色质重构复合体结合或者促进MLL1、MLL2 和MOZ 甲基化和乙酰化组蛋白，进一步通过表达遗传促进启动子的激活导致整个基因组转录异常。这些结果提示在p53 突变高频位点发生突变，可以通过调整整个染色体的稳态导致转录的激活，上调促癌基因的表达导致结肠癌的发生。

2.3 p53 突变丢失野生型功能与结肠癌

APC 基因突变激活Wnt 信号通路在结肠癌的发生和发展中起着至关重要的作用。在正常的肠系膜上皮细胞中，来源于基质细胞产生的Wnt 的配体刺激Wnt 上的卷曲受体，破坏APC、β-连环蛋白和GSK3β 复合体，导致β-连环蛋白的降解减少。因此，Wnt 信号通路维持β-连环蛋白的稳定性，促进其向细胞核内的聚集，与TCF形成复合体，进一步促进Wnt 信号通路下游基因的表达，以维持干细胞的正常数量和功能[13]。因此，APC 基因突变通过过度持续激活肠上皮细胞内Wnt 信号通路促进肠道癌症的发生和发展。

在使用药物（APCmin）或者基因敲除（APCΔ716）诱导APC 基因的小鼠模型中，持续激活Wnt 信号通路，会导致小鼠自发形成多发性肠息肉。为研究p53 突变引起的野生型p53 功能缺失在结肠癌发生、发展中的作用，研究者们构建了一些突变小鼠。在以c57bl/6 和129 杂合的基因背景APCmin 小鼠中加入无效等位基因的p53并没有导致结肠癌的进展加重[14]。有趣的是，APCminTrp53-/-基因背景为纯c57bl/6 小鼠时，结肠肿瘤的侵袭能力减弱。这些研究结果提示，p53突变引起的野生型p53 功能缺失在结肠癌早期的侵袭、转移中可能不起重要的作用，同时小鼠基因背景不一致也会导致结果不同。

2.4 p53 错义突变在结肠癌进展中的作用

在纯合子Trp53R270H/R270H小鼠中，p53 持续在细胞核内聚集。来源于APCΔ716 小鼠的类器官由于Wnt 信号通路的持续激活和分化障碍，其大体形态表现为椭圆形，但是当p53 缺失时，这一表型不发生改变[15]。相反，来源于纯合子Trp53R270H/R270H小鼠的类器官则表现出与Trp53 缺失小鼠完全不同的表型改变。这种肿瘤的腺状结构与Wnt 信号通路激活的程度有关。这些与p53 R270H 位点突变的蛋白表达水平相关的肿瘤表型可以通过使用异羟肟酸显著抑制，异羟肟酸是一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂，其通过Mdm2 介导的泛素化促进降解发生突变的p53 蛋白。

另外，与皮下移植来源于APCΔ716Trp53Null小鼠的类瘤组织相比，移植APCΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的类瘤组织表现出更严重的侵袭表型，例如上皮间质转化过程中细胞的形态表现出更多的分支和细胞外有大量的纤维环境和活化的成纤维细胞。当p53 发生突变的位点在R273H 时，肿瘤组织也表现出同样的形态，即在肿瘤组织周围存在大量的细胞分支[16]。研究发现肿瘤外环境中存在大量的纤维，可以促进肿瘤细胞的上皮间质转化的发生。另外，结肠癌周围有大量的变性纤维基质，与侵袭能力增强和预后不佳呈正相关。因此，p53发生错义突变促进结肠癌侵袭能力增强的机制可能与形成复杂的囊性结构，获得浸润能力以及诱导形成纤维基质形成相关。

2.5 p53 突变与炎症信号通路激活

大量的流行病学和基因组学研究证实，炎症反应会促进结肠癌的发生和发展，提示炎症可能是结肠癌治疗的一个潜在靶点。在肿瘤微环境中，有大量的巨噬细胞浸润和激活，这些巨噬细胞被称为肿瘤相关的巨噬细胞，表达CSF-1 和CCL2，而CSF-1 和CCL2 可能与肿瘤的侵袭和浸润有关[17]。另外，在化学刺激诱导的小鼠结肠炎-结肠癌模型中[18]，巨噬细胞会释放大量的细胞因子刺激肿瘤细胞、激活NF-κB 和Stat3 信号通路。但是，NF-κB 信号通路在肿瘤细胞中激活的机制仍然没有详细阐明。研究发现，p53 错义突变可能在结肠癌中NF-κB信号通路的激活起着重要的作用。例如，当p53 发生错义突变丢失其野生型的功能时，会加速化学刺激诱导结肠癌的发生和发展，以及上皮间质转化增加[19]。其机制可能与Trp53功能障碍时，抑制闭合蛋白和密封蛋白的表达，导致上皮的屏障功能障碍有关。而细菌的产物，例如脂多糖，会渗透进入结肠的固有层，导致结肠内固有巨噬细胞的激活，进一步导致NF-κB信号通路在肿瘤细胞和间质细胞的激活[20]。

研究发现，当R127H 位点发生p53 突变时，与化学刺激诱导的溃疡型结肠炎小鼠模型中肠道炎症持续激活有关，这会进一步导致溃疡相关的结肠癌的发生发展[21]。TNF-α 激活的NF-κB 信号通路会上调其下游靶基因在结肠上皮细胞内的表达。当p53 发生错义突变时，NF-κB 结合下游靶基因启动子的时间延长，导致炎症细胞因子的持续释放。在人类溃疡相关的结肠癌中，TP53 突变是炎症溃疡中最常见的突变。因此，结肠溃疡中发生p53 错义突变可能是导致结肠癌发生发展的原因之一，其机制可能与促进炎症反应有关。

Nakayama[22]等人通过使用来自ApcΔ716Trp53+/+，ApcΔ716Trp53Null，和ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的结肠肿瘤组织进行转录组基因测序，发现大约有350 个基因特异性的在ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的结肠肿瘤组织中表达上调。进一步通过生物信息学分析发现Wnt 信号通路和NF-κB信号通路在结肠癌组织中通过p53 突变R270 依赖性的方式激活。Nakayama 等人同样发现启动子结合能力在ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的接触肿瘤中显著增强，提示p53 突变打开了基因启动子的染色质结构，导致Wnt 信号通路和NF-κB 信号通路激活。p53 突变引起的Wnt 信号通路和NF-κB信号通路激活可能会维持肿瘤细胞的干细胞特性或未分化状态。

3 小结

深入研究结肠癌发生、发展的病理生理机制，对寻找新的潜在治疗靶点具有极其重要的理论和现实意义，是目前结肠癌研究领域的热点和难点问题。研究发现，促癌基因或抑癌基因表达和/或功能的异常在结肠癌的发生、发展以及化疗药物耐受和预后中起着重要的作用。随着近年来包括肿瘤类器官的培养技术在内的生物技术和基因测序技术突飞猛进的发展，人们能够应用多种敲基因或者转基因小鼠模型来研究结肠癌发生发展的机制。通过这些小鼠模型，研究者们发现持续存在的p53 错义突变，例如发生在R270H（人为R283H）位点的突变，在黏膜下层浸润，包括上皮间质转化、肿瘤转移中起着极其重要的作用。当p53 错义突变合并其他基因突变时，肿瘤的生长和转移会更加厉害。尽管近年来报道了一些p53 导致癌症发生发展的机制，但是p53 突变导致的染色质结构改变可能是导致促癌基因广泛表达的最关键原因。在结肠癌细胞中，Apc 基因突变激活Wnt 信号通路，同时炎症微环境也会导致NF-κB 信号通路的激活。另外，Wnt 信号通路和NF-κB 信号通路的相互作用会增强肿瘤细胞的干细胞特性和未分化状态。因此，p53 错义突变导致的染色质结构打开，导致Wnt 信号通路和NF-κB 信号通路处于持续激活状态是导致结肠癌发生发展的重要机制。

重要的是，p53 错义突变后在细胞核的聚集似乎是导致促癌基因表达和肿瘤发生的重要因素。尽管丢失野生型功能的p53 突变可能会导致p53稳定性增加，但有研究显示p53 突变的稳定性以及在核内聚集的能力仍然受到细胞内信号的调控。因此，需要进一步研究p53 突变后的稳定性以及其在核内聚集调控的细胞内信号通路。目前对于结肠癌的治疗一直未能找到十分有效的药物，传统的手术切除和化疗药物治疗并没有给结肠癌患者带来明显的获益，因此，迫切需要寻找新的结肠癌潜在治疗靶点，而这可以作为以后干预结肠癌的一个潜在治疗靶点。