细菌人工染色体微球技术对微缺失/微重复综合征的产前诊断

李一平，任华

西安市大兴医院妇产科，陕西 西安 710016

出生缺陷已成为影响儿童健康和出生人口素质的重大公共卫生问题，其中染色体疾病是婴幼儿出生缺陷的重要原因。传统的染色体核型分析是染色体疾病诊断的“金标准”[1]，可准确检测胎儿染色体数目异常及倒位、易位等结构异常，但该技术培养周期长、操作要求高、易失败，对5Mb以下的染色体缺失/重复无法正确检出。事实上，这些缺失/重复往往会导致复杂的临床表现，如生长发育异常、智力迟缓、特殊面容、内脏器官畸形、内分泌异常、精神行为改变等[2,3]。微缺失/微重复综合征出生后诊断相对容易，但几乎没有有效的治疗方法。因此，产前诊断的临床意义重大。细菌人工染色体微球技术(bacterial artificial chromosomes-on-beads，BoBs)无需细胞培养、高通量，能够快速检测5种常见的染色体非整倍体(13、18、21、X和Y染色体)异常及9种微缺失综合征(Wolf-Hirschhorn综合征、Cri du Chat综合征、Williams-Beuren综合征、Langer-Giedion综合征、Prader-Willi综合征、Angelman综合征、Miller-Dieker综合征、Smith-Magenis综合征及DiGeorge综合征)，提供了更丰富的信息，提高了产前诊断效率。本文对1 549份羊水进行BoBs快速检测，探讨其在微缺失/微重复综合征检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月至2019年2月在西安市大兴医院因具有产前诊断指征行羊水穿刺的孕妇1 549例，平均年龄(30.06±5.02)岁，平均孕周(21.90±3.90)周。孕妇的产前诊断指征包括：高龄(≥35岁)；超声异常；无创产前检测高风险；血清学筛查高风险；不良孕产史；其他(家族遗传病史、夫妻一方染色体异常等)。所有孕妇均签署产前诊断知情同意书，行染色体核型分析及BoBs检测，如遇微缺失/微重复综合征，样本增加荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)或染色体微阵列分析(chromosomemicroarray analysis，CMA)检测。

1.2 方法

1.2.1 羊膜腔穿刺 常规超声引导下行羊膜腔穿刺术抽取羊水30 mL，15 mL用于细胞培养，10 mL用于DNA提取，5 mL用于FISH检测。

1.2.2 染色体核型分析 15 mL羊水按照常规方式进行细胞培养、收获、制片、G显带，每例样本计数30个分裂相，分析3～5个核型。发现染色体异常或多态性变异时，计数50个分裂相并适当增加分析的核型数。

1.2.3 BoBs检测 10 mL羊水2 000 r/min离心10 min，弃上清，利用QIAamp®DNA Blood Mini Kit(德国Qiagen公司)提取基因组DNA。按照Prenatal BACs-on-BeadsTM试剂盒(美国Perkin Elmer公司)说明书对DNA进行标记、纯化、与BoBs探针杂交过夜及报告分子链霉亲合素-藻红蛋白结合，洗涤后Luminex®200TM读取信号强度，BoBsoft®2.0软件进行结果分析。

1.2.4 CMA检测 样本DNA利用Affymetrix公司CytoScan 750K芯片检测基因组DNA拷贝数变化、单亲二倍体及杂合性缺失等，Chromosome Analysis Suite(ChAS)软件进行结果判读。

1.2.5 FISH检测 5 mL羊水行细胞处理、玻片处理、变性杂交、洗片、复染后于荧光显微镜下观察。每例样本随机计数至少50个细胞，如果无法判读则扩大计数。FISH探针及试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。

2 结果

2.1 BoBs技术对微缺失/微重复综合征的检出情况 1 549份羊水中BoBs共检出微缺失/微重复综合征8例，检出率为0.52%。其中Xq27.3缺失综合征1例，7q11.2重复综合征1例，Xp22.31缺失综合征2例，18p11.32p11.21重复综合征1例，8q23.3缺失综合征1例，4p16.3重复综合征1例，22q11.2缺失综合征1例，见图1。22q11.2缺失综合征进行FISH验证，其余综合征CMA进行验证，结果均与BoBs一致。

图1 BoBs检测的微缺失/微重复综合征

2.2 染色体核型分析对微缺失/微重复综合征的检出情况 染色体核型分析只检出缺失/重复3例，其中缺失/重复区域均在10 Mb左右，见表1。病例1：孕妇因血清学21三体筛查高风险行羊水穿刺，核型结果为46，XX，del(X)(q27.3_q28)，BoBs结果显示46XX，Xq27.3缺失，CMA结果发现Xq27.2q28(140 508 944_155 233 098)区域出现14.7Mb缺失；病例4：染色体核型分析发现标记染色体存在，不确定其来源，BoBs结果显示46XX,18p11.32p11.21重复，CMA验证发现18p11.32p11.21(136 285_15 143 614)x4：15Mb，即18号染色体p11.32p11.21区域存在15Mb重复，为18p四体综合征，其重复区域涉及SMCHD1、LPIN2、TGIF1等重要基因，可能导致发育迟缓、智力障碍、心脏及肾脏异常等严重问题；病例6：因21三体风险值1/109于孕19周行羊水穿刺，核型结果为46，XX，del(8)(q23.1q23.3)，BoBs结果发现8q23.3区域存在缺失，随后CMA检测精确定位发现8号染色体q23.1q23.3区域缺失9.4Mb，该缺失区域包含TRPS1、EMC2、TRHR、NUDCD1、SYBU等13个OMIM基因，诊断该胎儿为TRPSⅠ型综合征，孕妇在染色体核型分析、BoBs和CMA检测结果均异常并进行遗传咨询后选择终止妊娠，引产下胎儿可见明显异常，如毛发稀疏、梨状鼻、小下颌、短趾畸形等。

表1 8例微缺失/微重复综合征的检测结果

3 讨论

目前，染色体疾病尚无有效地治疗方法，给家庭和社会带来沉重的经济负担，唯一可采取的途径是尽早进行遗传咨询及产前诊断。染色体核型分析是染色体疾病诊断的“金标准”，但其分辨率低，对5 Mb以下的染色体缺失/重复很难正确检出，可能存在一定的漏检风险。与传统染色体核型分析相比，BoBs技术无需细胞培养、快速、高通量、准确性高，除了检测5种染色体非整倍体外，还可对9种常见的微缺失综合征进行检测，同时其覆盖的探针是已知疾病的关键区域，结果明确，易于解读，提高了产前诊断的效率，降低了遗传咨询的难度[4-5]。LI等[6]、HUANG等[7]研究发现，BoBs技术除了准确检出所有的染色体非整倍体，同时对微缺失/微重复综合征的检出能力明显优于染色体核型分析，是一种可选择的稳定准确的新技术。

本研究利用BoBs技术对1 549份羊水进行快速检测，共发现微缺失/微重复8例，检出率为0.52%，其中微缺失综合征5例，微重复综合征3例，同时产前BoBs结果与FISH、CMA验证结果完全一致，体现了该技术在微缺失/微重复综合征检测方面具有较高准确性及可靠性。此外，染色体核型分析仅检出3例，且缺失/重复区域均在10 Mb左右，联合BoBs技术扩大了0.32%的检出率，避免了一定的假阴性结果。本研究中微缺失/微重复的检出率较国内外报道偏低[8-9]，可能与微缺失/微重复综合征本身的发病率较低有关，其次目前检测的样本量不够大，可能存在一定范围的误差。

近年来，随着多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)、荧光定量聚合酶链式反应(QF-PCR)、FISH、CMA、BoBs等技术在临床上的广泛应用，越来越多的微缺失/微重复综合征胎儿被发现[10-14]。目前临床上可作为微缺失综合征预测的产前高危因素包括特征性脏器畸形(主要为心脏畸形)；宫内发育迟缓/姿态异常；羊水过多/过少；父母之一有明确微缺失综合征等。因此，当遇到染色体核型分析结果正常，应密切关注后期超声结果，一旦超声诊断异常，需考虑进行下一步检测排除微缺失/微重复等，必要时尽可能对胎儿父母样本进行分析，这对于染色体变异来源确定具有重要意义[15]。

综上所述，BoBs技术是一种敏感、可靠的检测技术，由于覆盖了更多疾病，对传统的染色体核型分析进行了很好地补充和完善，在提高染色体异常检出率的同时缩短了检测时间，适合大量样本的快速处理，值得在临床中广泛推广及应用。