西藏开菲尔发酵乳中挥发性风味物质分析

高薇，张兰威，2，*

（1.哈尔滨工业大学化工与化学学院，黑龙江哈尔滨150000；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266000）

西藏开菲尔粒是我国西藏地区珍贵的天然发酵剂，它具有在牛奶中增殖的能力，使用其发酵制作的乳饮料称作西藏开菲尔发酵乳[1-2]。研究表明，西藏开菲尔发酵乳是一种具有潜力的功能性乳制品，西藏开菲尔粒及其发酵乳中的微生物具有多种保健功能[3-5]。

风味是决定发酵乳制品消费者接受度的重要属性，产挥发性风味物质的能力是评价发酵剂应用于发酵乳制品生产的基本参数[6-7]。气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是目前应用最广泛的风味分析技术，其在挥发性化合物的分离和鉴定方面具有优异性能[8]，该技术已成功应用于多种发酵乳制品中挥发性化合物的检测[9-11]。香气活力值（odor activity value，OAV）是指成分在体系中的绝对浓度与其感觉阈值的比值，通过比较各成分的OAV 差异，可以评价其对食品风味贡献度的差异。OAV>1 的化合物被认为是食品中的香气贡献成分，该值的大小与其香气贡献成正比[12-13]。

开菲尔粒中细菌和酵母菌的共同作用使得开菲尔发酵乳具有独特的酸醇混合风味[7]。目前，关于西藏开菲尔发酵乳挥发性风味特性研究报道较少。本研究采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对两种不同地理来源西藏开菲尔粒的发酵乳中挥发性成分构成进行分析，比较了两种西藏开菲尔粒的产挥发性风味物质能力差异，并首次结合香气活力值计算确定了两种西藏开菲尔发酵乳中的香气贡献成分，本研究意义在于为西藏开菲尔产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

西藏开菲尔粒A 和B 分别采集自西藏地区两个地理位置不同的县；巴氏杀菌全脂牛乳：完达山乳业股份有限公司；C7-C30 正构烷烃（色谱纯）、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头：美国Supelco 公司；7890A-5975C 型气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 西藏开菲尔发酵乳的制备

取低温保存的西藏开菲尔粒接种于巴氏杀菌全脂牛乳中，置于28 ℃恒温培养箱中培养活化3 次。之后，分别接种活化好的每种西藏开菲尔粒50 g 于1 L的巴氏杀菌全脂牛乳中，置于28 ℃恒温培养箱中培养，待发酵乳pH 值降至4.5 时取出用于后续分析。

1.2.2 挥发性化合物的提取

使用顶空固相微萃取的方法提取发酵乳中的挥发性化合物。取8 g 发酵乳于15 mL 顶空瓶中，加入2 g氯化钠，置于60 ℃孵育20 min，之后插入固相微萃取头，在60 ℃萃取30 min。萃取完成后拔出萃取头，将其插入气相色谱进样口在250 ℃解吸5 min，进行气相色谱-质谱联用分析。以1，2-二氯苯为内标物。

1.2.3 气相色谱-质谱联用分析

色谱柱：DB-WAX 毛细管柱（30 m × 0.32 mm ×0.25 μm）。

升温程序：40 ℃，保持 3 min，以 4 ℃/min 的速度升温至180 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min 的速度升温至200 ℃，保持20 min。载气为氦气，流速为1.1 mL/min。

质谱条件：EI 离子源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度 230 ℃，四级杆温度150 ℃，质量扫描范围30 m/z～500 m/z。

1.3 定性定量分析

化合物的定性鉴定通过与NIST08 质谱数据库中标准质谱图检索比对并利用C7-C30 正构烷烃的保留时间计算各化合物的Kovats 保留指数RI 值两种方法结合确定。化合物的定量分析采用内标法。RI 值根据如下公式进行计算：

式中：t'（i）为样本中待分析化合物的保留时间；n和n＋1 分别为待分析化合物留出前、后相邻的正构烷烃的碳原子数；t'（n）和t'（n＋1）分别为碳数为n 和n＋1的正构烷烃的保留时间。

1.4 香气活力值计算

香气活力值（OAV）的计算公式如下[14]：

式中：ρ 为样本中化合物的质量浓度，mg/kg；T 为该化合物在水中的气味阈值，mg/kg。

2 结果与分析

两种发酵乳中共鉴定出挥发性化合物30 种，包括醇类（5 种）、酯类（7 种）、酸类（12 种）、酮类（5 种）和芳香族类（1 种），结果见表1。发酵乳A 中检测到挥发性化合物26 种，B 中检测到挥发性化合物28 种，B 中的挥发性化合物总量高于A。

图1 为西藏开菲尔发酵乳中挥发性成分总离子流图，图中色谱峰分布均匀且分离效果好。图2 为西藏开菲尔发酵乳中挥发性化合物分类饼状图，图中两种发酵乳中各类挥发性化合物比例不同，酸类和醇类在两者中都占优势，两类的相对丰度总和在各发酵乳中都达80%以上。

2.1 醇类化合物

本研究中，醇类在两种西藏开菲尔发酵乳中比例和含量均较高，A 中相对丰度达51.34%（15.39 mg/kg），B 中相对丰度达45.27%（15.31 mg/kg），两种发酵乳中醇类总量差异不大，表明两种西藏开菲尔粒的产醇能力相当。

表1 西藏开菲尔发酵乳中挥发性化合物GC-MS 及OAV 分析结果Table 1 Results of GC-MS and OAV analyses for volatile compounds in Tibetan kefir miks

图1 西藏开菲尔发酵乳中挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatiles in Tibetan kefir miks

图2 西藏开菲尔发酵乳中挥发性化合物分类饼状图Fig.2 Pie chart of classified volatile compounds in Tibetan kefir milks

由表1 可知，检出的5 种醇类化合物中4 种为两种发酵乳共有。乙醇的比例和含量在两种发酵乳中均为醇类中最高。两种发酵乳的醇类中OAV>1 的香气贡献成分都为乙醇、异戊醇和苯乙醇，其中苯乙醇OAV>10，在两种发酵乳中都是重要香气贡献成分。乙醇是酵母菌无氧代谢和具有乙醇脱氢酶活性的异型发酵乳酸菌的主要代谢产物[16]，它是使得开菲尔被称为“乳中香槟”的原因之一[17]。异戊醇和苯乙醇是两种高级醇，异戊醇具有“鲜奶酪”、“醇”和“果香”的风味[18-19]，苯乙醇具有清甜的“玫瑰花香”[20]，两者在酸乳制品中很少检出，由于本研究使用的发酵剂西藏开菲尔粒中不仅包含乳酸菌等细菌，还包含酵母菌，它们共同作用产生的这两种醇可能赋予开菲尔发酵乳以酸乳不具备的特色风味。

2.2 酯类化合物

酯类化合物源于发酵乳中酸类和醇类的酯化作用，在发酵乳制品中通常浓度和比例不高，但阈值较低，且普遍具有果香味，使得其成为发酵乳制品中重要的风味物质之一[21-22]。本研究中，两种西藏开菲尔发酵乳中酯类的比例和含量不高，A 中相对丰度为4.65%（1.39 mg/kg），B 中相对丰度为 4.82 %（1.63 mg/kg），B中酯类总量高于A，表明西藏开菲尔粒B 的产酯能力强于粒A。由表1 可知，检出的7 种酯类化合物中4 种为两种发酵乳共有。乙酸苯乙酯在发酵乳A 中特有，乙酸异戊酯和己酸乙酯在B 中特有。乙酯类是两种发酵乳中的主要酯类，乙酸乙酯在两种发酵乳中的比例和含量均为酯类中最高。文献查询到的6 种酯类化合物的阈值都很低，对于两种发酵乳，酯类化合物的总OAV 值远高于其他4 类化合物，表明酯类是两种发酵乳中最重要的香气贡献化合物。发酵乳A 中OAV>1的酯类香气贡献成分有4 种，其中OAV>10 的重要香气贡献成分为乙酸乙酯和辛酸乙酯；发酵乳B 中OAV>1 的酯类香气贡献成分有5 种，其中OAV>10 的重要香气贡献成分为乙酸异戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯。在两种发酵乳的所有酯类中，辛酸乙酯的OAV 均远大于其他酯类，是最重要的香气贡献成分，同时，发酵乳B 中辛酸乙酯的OAV 远大于A，表明它在B 中的香气贡献远大于A。辛酸乙酯具有令人愉快的“花果”香味[20]，结合其OAV 分析和香气特征，推测发酵乳B 的“花果”香味较 A 更为浓郁。

2.3 酸类化合物

酸乳制品中酸类化合物主要由脂肪分解作用和细菌（主要为乳酸菌）发酵作用产生[21]。本研究中，两种西藏开菲尔发酵乳中的酸类比例和含量均较高，A 中相对丰度达 43.21 %（12.95 mg/kg），B 中相对丰度达47.67%（16.12 mg/kg），B 中酸类总量高于 A，表明西藏开菲尔粒B 的产酸能力强于粒A。两种发酵乳中检出的酸类种类相同，中短链脂肪酸为主要酸类，辛酸在两种发酵乳中的比例和含量均为酸类中最高。文献查询到了8 种酸类化合物的阈值，两种发酵乳的酸类中OAV>1 的香气贡献成分都为己酸、辛酸、癸酸和十二酸，发酵乳A 中OAV>10 的重要香气贡献成分为己酸，发酵乳B 中OAV>10 的重要香气贡献成分为己酸和辛酸。己酸具有“干酪样”气味，辛酸具有微弱的“水果酸味”，癸酸具有“油酸败味”，十二酸具有“月桂油”气味[20]。虽然酸类在两种发酵乳中含量很高，但它们的阈值较高，两种发酵乳中酸类的总OAV 远低于酯类，表明酸类对两种发酵乳整体风味构成的作用是辅助性的，主要赋予其“干酪样”和“酸”的风味特性。

2.4 酮类化合物

酮类化合物源于不饱和脂肪酸的氧化、热降解、氨基酸降解作用以及微生物代谢[23]。本研究中，两种西藏开菲尔发酵乳中酮类的比例和含量均较低，其在A中相对丰度仅为0.80%（0.24 mg/kg），在B 中相对丰度为1.45%（0.49 mg/kg），B 中酮类总量高于A，表明西藏开菲尔粒B 的产酮能力强于粒A。由表1 可知，检出的5 种酮类化合物中4 种为两种发酵乳共有，乙偶姻在两种发酵乳中的比例和含量均为酮类中最高。本研究检测到的5 种酮类化合物的阈值较低，但因其含量也较低，两种发酵乳中的酮类OAV 都小于10，且总OAV 都低于酯类、醇类和酸类，表明其香气贡献低于酯类、醇类和酸类。发酵乳A 中OAV>1 的酮类香气贡献成分有3 种，B 中OAV>1 的酮类香气贡献成分有4种。乙偶姻、2-壬酮和2-十一烷酮是两种发酵乳共有的酮类香气贡献成分。乙偶姻具有典型的“奶油”香味，2-壬酮具有“果香”、“甜香”及“乳酪”香味，2-十一烷酮具有“果香”和“酮香”香味[20]。发酵乳B 中酮类的总OAV 高于A，结合其香气特征，推测它们赋予B 的“果香”和“奶油”香味较A 更为强烈。

2.5 芳香族类化合物

本研究中仅在西藏开菲尔发酵乳B 中检测到了1种芳香族类化合物苯乙烯，它在B 中的比例和含量都很低，相对丰度仅为0.80%（0.27 mg/kg）。苯乙烯的OAV 大于10，是发酵乳B 中的重要香气贡献成分，具有“芳香”、“香脂香”及接近“花香”的气味[20]。

3 结论

采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术与香气活力值的计算确定了两种不同地理来源西藏开菲尔粒的发酵乳中挥发性成分构成及香气贡献成分。结果共鉴定出挥发性化合物30 种，酸类和醇类在两种发酵乳中占优势。两种西藏开菲尔粒的产挥发性风味物质能力存在差异，西藏开菲尔发酵乳B 中鉴定出的挥发性化合物种类和总含量均高于A，且B 中除醇类总量略低于A 外，酯类、酸类、酮类和芳香族类总量均高于A。OAV 分析表明酯类是两种发酵乳中最重要的香气贡献化合物，辛酸乙酯是两种发酵乳中香气贡献最高的风味物质。不同类别化合物对两种发酵乳的总香气贡献存在差异，醇类对发酵乳A 的总香气贡献高于B，酯类、酸类和酮类对发酵乳B 的总香气贡献高于A。