蒲公英多糖脱色脱蛋白方法及其降血糖活性研究

郭慧静，张伟达，陈国刚

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

蒲公英（Taraxacum mongolicum）为菊科蒲公英属，是药食同源的多年生草本植物，产于黑龙江、内蒙古、山西、甘肃及新疆等省区，种质资源丰富且较易获得[1]。蒲公英除了可以鲜食以外，还可以作为药材使用，于2014 年被国家卫生计生委列入药食同源目录[2-3]。鲜食蒲公英可以起到清热解毒、消痈散结等功效；提取其功能性成分，可以有抗炎、抗肿瘤、降糖等作用；由于其药用和食用价值日益被开发，蒲公英得到了众多消费者的青睐。

植物多糖，是一种结构复杂的大分子化合物。大量研究表明从各种生物体内提取的多糖都具有多种药理活性，如抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖、免疫调节和抗氧化等[4-6]功能，因此，多糖类物质的研究与开发一直是近年来的研究热点。随着科学技术的不断更新，越来越多的植物多糖被研究并加工利用。多糖也是蒲公英重要的活性成分之一，已有研究表明，蒲公英多糖具有抗菌、抗肿瘤，抗氧化等作用[7-8]。然而，多糖在提取过程中通常含有部分杂质，主要包括蛋白质和色素，不仅影响多糖的生物活性，对后期多糖的分离纯化和结构测定也带来较大困难[9]。因此，研究一种脱蛋白和脱色效果较好的工艺非常重要。

本试验以蒲公英全草为研究对象，以脱色率、脱蛋白率和多糖损失率为考察指标，对不同脱色方法和脱蛋白方法的作用效果进行比较，寻求最佳的蒲公英多糖初步纯化工艺，进一步对纯化前后蒲公英多糖的体外降血糖能力进行评价，考察其作为降血糖药物的应用前景，推动蒲公英多糖在功能食品及医药产业中的开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒲公英全草：采集于新疆哈密地区；粉末活性炭：广东韩研活性炭制造有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝 G-250：美国 Sigma 公司；木瓜蛋白酶（80 000 U/g）：上海生化试剂厂；大孔树脂：北京英莱克科技发展有限公司；α-葡萄糖苷酶、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷（4′-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，PNPG）：上海宝曼生物科技有限公司；苯酚、浓硫酸、葡萄糖、无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、三氯乙酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-2 型数显恒温水浴锅：荣华仪器制造有限公司；Multifuge X1R 型高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技有限公司；EL3002 型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；RE-3000 型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；78-1 型磁力搅拌器：江苏金怡科技有限公司；BK-FD12T 型冷冻干燥机：山东博科科学仪器有限公司；UV-2600 型紫外分光光度计：岛津仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 分析方法

1.3.1.1 蒲公英多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法[10]对蒲公英多糖含量进行测定。精确称取葡萄糖标准品100 mg，用蒸馏水配成1 mg/mL的葡萄糖溶液。取上述溶液10 mL 配制成0.1 mg/mL葡萄糖储备溶液，备用。分别量取储备溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中，加蒸馏水补至 2.0 mL，得到不同浓度的葡萄糖标准溶液。分别向上述各试管中加入6%苯酚溶液1.0 mL 摇匀，再沿壁迅速加入5.0 mL 浓硫酸混匀，沸水浴30 min 后取出冷却至室温（25 ℃），以蒸馏水作空白，于490 nm 处测吸光值。

1.3.1.2 多糖中蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝G-250 法[11]对多糖中蛋白质含量进行测定。精密称取100 mg 考马斯亮蓝G-250，用50 mL 95%乙醇溶解，再加入85%磷酸溶液100 mL，以蒸馏水定容于1 L 容量瓶，得考马斯亮蓝染色液。称取5 mg 牛血清蛋白溶于50 mL 0.9 %生理盐水制成0.1 mg/mL 的标准液。分别移取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 标准液于具塞试管内，用生理盐水补到1 mL，逐管加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 染液，混匀，25 ℃室温条件下静置3 min 后，在595 nm 检测吸光值。

1.3.2 蒲公英粗多糖的制备

将采集的蒲公英清洗后50 ℃烘干，用粉碎机粉碎并过60 目筛，用石油醚回流脱脂后进行超声辅助热水提取，以1 ∶25 g/mL 料液比于75 ℃超声波清洗器中，以120 W 的超声功率浸提65 min，抽滤除去残渣，5 000 r/min 离心10 min 取上清液，将上清液浓缩至原体积的20%，加入无水乙醇使乙醇体积分数至80%，4 ℃静置过夜，4 000 r/min 离心 10 min 收集沉淀，分别用无水乙醇、甲醇、丙酮洗涤3 次，真空冷冻干燥即得蒲公英粗多糖。

1.3.3 蒲公英多糖脱色

1.3.3.1 活性炭法

取粗多糖配成5 mg/mL 粗多糖溶液20 mL，调节样液pH 值为4.0，加入2%的活性炭，在50 ℃下恒温振荡脱色50 min，按下列公式计算多糖脱色率、多糖损失率：

多糖脱色率/%=（脱色前吸光值-脱色后吸光值）×100/脱色前吸光值

多糖损失率/%=（脱色前多糖吸光值-脱色后多糖吸光值）×100/脱色前多糖吸光值

1.3.3.2 过氧化氢法

取5 mg/mL 粗多糖溶液20 mL，调节样液pH 值为9.0，加入10%的H2O2，在60 ℃恒温条件下脱色3 h，计算多糖脱色率、多糖损失率。

1.3.3.3 壳聚糖法

取5 mg/mL 粗多糖溶液20 mL，调节样液pH 值为5.0，加入5%的壳聚糖，在常温条件下振荡脱色1 h，计算多糖脱色率、多糖损失率[12]。

1.3.3.4 大孔树脂吸附法

采用 AB-8 树脂、DM301 树脂、D101 和 NKA-9 对粗多糖进行脱色处理，比较4 种大孔树脂的脱色效果。称量预处理后的树脂10 g 与20 mL 粗多糖溶液（5 mg/mL）混合，在38 ℃条件下振荡脱色2 h，抽滤，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，计算多糖脱色率和多糖损失率。

1.3.4 蒲公英多糖脱蛋白

1.3.4.1 盐析法[13]

取40 mL 脱色后的蒲公英多糖溶液，调节样液pH值为8，加入氯化钙粉末至10%，85 ℃搅拌10 min，冷却后离心（4 000 r/min，10 min）去沉淀，收集上清液，按下列公式计算多糖脱蛋白率和多糖损失率：

脱蛋白率/%=（脱蛋白前蛋白吸光值-脱蛋白后蛋白吸光值）/脱蛋白前蛋白吸光值×100

多糖损失率/%=（脱蛋白前多糖吸光值-脱蛋白后多糖吸光值）/脱蛋白前多糖吸光值×100

1.3.4.2 Sevag 法

取40 mL 脱色的蒲公英粗多糖溶液6 份，设置3 次～7 次脱蛋白处理。每份多糖溶液中加入1/4 体积的 Sevag（V氯仿∶V正丁醇=4 ∶1）试剂，常温振荡 30 min，离心（4 000 r/min，10 min）取上层溶液测定蛋白质含量和多糖含量，并计算多糖脱蛋白率和多糖损失率。

1.3.4.3 酶-三氯乙酸（trichloroa cetic acid，TCA）法

取粗多糖溶液40 mL，加入1.2%的木瓜蛋白酶、调节pH 为5.5，50 ℃水浴3 h 进行酶解，反应后沸水浴灭活5 min，离心取上清液。加入糖质量分数为0.1%的三氯乙酸，搅拌均匀，60 ℃水浴30 min，计算酶-三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法的脱蛋白率和多糖损失率[14]。

1.3.4.4 酶-Sevag 法

取粗多糖溶液40 mL，37 ℃水浴10 min。按1.3.4.3节酶解的条件对预热后的多糖溶液进行脱蛋白处理，对酶解后的多糖溶液按1.3.4.2 节Sevag 法再次进行脱蛋白处理，取上清液，计算酶-Sevag 法的脱蛋白率和多糖损失率[15]。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

根据文献[16]方法并稍加修改，取浓度为0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液0.1 mL 加入2 mL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8），37 ℃水浴 15 min，加入样品溶液反应10 min 后再加入0.25 mL 25 mmol/L PNPG。水浴30 min后，加入0.1 mol/L 2 mL Na2CO3终止反应，于 400 nm 处测定吸光度（A2）；以1 mL 缓冲液替代样品溶液，测其吸光度值为（A0）；以0.1 mL 缓冲液替代酶液测定其吸光值为（A1）。重复测定3 次，并以阿卡波糖为阳性对照。

此外，酶活力定义为37 ℃、pH 6.8 条件下，1 min内水解底物（PNPG）产生1 μmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.4 数据分析

以上试验均在最佳条件下操作且每组数据进行3次平行试验，试验结果采用3 次重复平均值±标准差（SD）表示，采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析，用Origin 8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

葡萄糖及蛋白质的标准曲线见图1。

图1 葡萄糖和蛋白质标准曲线Fig.1 Standard curves of glucose and protein

以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线如图1 a，得回归方程：Y=0.015 5X-0.009 8，式中Y 为吸光值（490 nm），X 为葡萄糖质量浓度（μg/mL），R2=0.999 6，线性范围为 0～50 μg/mL。以牛血清蛋白质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线如图1 b，得回归方程：Y=0.006 2X+0.010 9，式中 Y 为吸光值（595 nm），X 为蛋白质量浓度（μg/mL），R2=0.999 2，线性范围为 20～100 μg/mL。

2.2 蒲公英多糖脱色方法比较

4 种树脂的性质及对蒲公英多糖脱色效果的影响见表1。

表1 不同类型树脂的性质及脱色效果Table 1 Properties and decolorizing effect of different resins

由表1 可知，大孔树脂S-8 是极性树脂，对极性有机化合物吸附能力较强。蒲公英粗多糖溶液经S-8 树脂吸附后，脱色率达到86.45%，显著高于AB-8、DM301和D101 树脂且多糖损失率也较低，说明蒲公英粗多糖溶液中所含色素的极性与大孔树脂S-8 的极性相近，脱色效果较好。因此，选择大孔树脂S-8 作为最佳吸附介质与其它3 种方法进行比较，结果如图2 所示。

图2 多糖脱色方法的比较Fig.2 Comparison of polysaccharide decolorization methods

由图2 可知，4 种脱色方法在的脱色率均在75%以上，其中过氧化氢法脱色率最高，达到93.21%。过氧化氢是强氧化剂，可以把有色物质氧化变为无色，但其氧化色素的同时多糖也容易被分解，因此损失率相对较高。活性碳因其吸附性较强，也具有较好的脱色效果，但吸附色素的同时也易吸附一定量的多糖，使得多糖损失率相对较高。采用大孔树脂S-8 和壳聚糖进行脱色时，多糖损失率无显著差异，但大孔树脂脱色率更高，且树脂可以再生重复利用。因此，采用大孔树脂S-8 对蒲公英粗多糖溶液进行脱色。

2.3 蒲公英多糖脱蛋白方法比较

蒲公英多糖Sevag 法脱蛋白结果见表2。

表2 Sevag 法分次脱蛋白结果Table 2 The deproteinization results of polysaccharide with Sevag by different times

由表2 可知，采用Sevag 法脱蛋白时，随着试验次数的增加，蛋白质的脱除率逐渐增加，多糖损失率也逐渐增加。经6 次脱蛋白后，蛋白质脱除率趋于平缓。因此，采用Sevag 法脱蛋白时选择脱蛋白次数为6 次最佳，此时蛋白脱除率为80.82%，多糖损失率为45.16%。多糖损失较多，可能是因为Sevag 试剂在使蛋白质变性沉淀的同时会造成多糖的损失，且脱蛋白次数越多，重复操作过程也使多糖的损失增加[17]。

不同方法脱蛋白结果如图3 所示。

图3 多糖脱蛋白方法的比较Fig.3 Comparison of polysaccharide deproteinization methods

4 种脱蛋白方法的脱蛋白率均在80%以上，其中酶-TCA 法脱蛋白效果最佳，蛋白质脱除率达到90.73%，且多糖损失率仅为22.07%。然而，TCA 在水解蛋白质的同时可能会在一定程度上破坏多糖的结构，影响多糖的活性[18]。Sevag 法多次重复也可以很好地去除蛋白质，但操作繁琐耗时较多，且多糖损失率较高。酶-Sevag 法和盐析法相比，多糖损失率无显著差异（p＞0.05），且脱蛋白效果均相对较好，分别为84.09%和85.64%。综合考虑脱蛋白率、多糖损失率、操作简便性及对多糖结构和活性的影响等因素，采用盐析法对蒲公英粗多糖溶液进行脱蛋白处理，进行蒲公英粗多糖的初步纯化。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制能力分析

蒲公英多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力见图4。

图4 蒲公英多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.4 The inhibiting effects of polysaccharides from dandelion on α-glucosidase

由图4 可知，蒲公英多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力随着多糖质量浓度的增加逐渐增强，呈显著的量-效关系。纯化前后蒲公英多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力IC50值分别为0.65 mg/mL 和0.55 mg/mL，在质量浓度为1 mg/mL 时，抑制能力分别达到76.28%和65.16%，说明经脱色和脱蛋白后的多糖较纯化前对α-葡萄糖苷酶的抑制能力增强，可能是因为蒲公英粗多糖经处理后的纯度得到了提高。

3 结论

本试验以脱色率、脱蛋白率和多糖损失率为考察指标，比较了4 种脱色方法和4 种脱蛋白方法，结果表明大孔树脂S-8 脱色效果较好，其色素脱除率为86.45%，多糖损失率为18.9%，因此，选择S-8 树脂对粗多糖进行脱色处理。脱蛋白方法中，Sevag 法重复处理多糖损失率最高；采用酶-TCA 法处理时脱蛋白率最高，但TCA 会分解多糖从而增加多糖损失率并破坏其结构。因此，比较试验结果后选择盐析法对脱色后的蒲公英多糖进行脱蛋白处理，脱蛋白率为85.64%，多糖损失率为20.51%。蒲公英粗多糖和经初步纯化制得的精制多糖对α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用，在质量浓度为1.0 mg/mL 时，抑制率分别为65.16%和76.28%。由此可知，经本试验筛选的脱色、脱蛋白方法切实可行，降低了粗多糖中色素和蛋白质的含量，制得的蒲公英精制多糖具有良好的降血糖活性，可为进一步研究和利用蒲公英多糖提供理论依据。