网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶体外抑制作用的研究

冯学珍，覃慧逢，冯书珍

（广西科技大学，广西柳州545006）

糖尿病是一种由胰岛素绝对或相对缺乏引起的慢性代谢紊乱性疾病，它的特点是血糖过高，碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢紊乱，是一个全球健康问题[1]。临床上将糖尿病分为几种类型，其中Ⅱ型糖尿病患者占90%以上，表现为餐后高血糖，这可能与葡萄糖摄取或糖原分解或糖异生作用有关。因此，葡萄糖摄取可能是一个治疗靶点，抑制α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，EC 3.2.1.20）的活性，延缓食物中碳水化合物分解转化为葡萄糖，减少葡萄糖的吸收从而降低餐后血糖浓度[2]。α-葡萄糖苷酶抑制剂作为治疗Ⅱ型糖尿病的有效药物，越来越受到人们的青睐[3-5]。

海藻多糖是一类多组分的混合物，因其来源于海洋，加之海藻多糖具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等药理活性，成为目前海洋药物研究的热点之一[6]。研究发现，海藻中普遍含有能抑制α-葡萄糖苷酶活性的物质[7]，如海藻脂溶性提取物、海藻多酚等[8-9]。网地藻（Dictyota dichotoma）是褐藻门、褐藻纲、网地藻目、网地藻科、网地藻属的一种海洋藻类。广西北部湾地处亚热带海洋性季风气候，岸线曲折，深水条件好，其沿海三市存在食用、药用藻类品种繁多[10]。其中褐藻门（Phaeophyta）中研究较少的网地藻，当地居民曾用于疮疖、脚气及肠炎的治疗。目前关于网地藻的研究主要集中于对其化学成分、抑菌、抗氧化等活性的研究，其它领域研究相对较少[11-13]。本研究在课题组前期研究的基础上，对网地藻多糖的降糖活性进行了初步研究，为开发天然α-葡萄糖苷酶抑制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试的网地藻采自广西北部湾海域，经大连海洋大学邢坤副教授鉴定为鹿角网地藻（Dictyota cervicornis），经反复水洗、干燥、粉碎后备用。

4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶 （α-Glucosidase）：Sigma 公司，阿卡波糖（阿卡波糖≥99.5%）、对硝基苯酚（4-Nitrophenol，pNP≥99.5%）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：麦克林试剂公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Multiskan GO 酶标仪、Nicolet 6700 傅立叶红外光谱仪：美国热电公司；EYELA N-1300v-WB 旋转蒸发仪、UV-2600 紫外分光光度计：日本岛津公司；DL-180J 智能超声波清洗器：上海之信仪器有限公司；FD-1C-50 冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；SHB-III 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；PHS-25 酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司；AL104 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 网地藻多糖样品的制备

参照文献[11]的方法进行，将干燥后的网地藻粉末（5 g）乙醇浸泡过夜挥干，加 30 倍（150 mL）蒸馏水，在75 ℃，pH 7.0 的条件下超声（功率200 W）辅助水提取30 min，离心除去滤渣，上清液减压浓缩，80%无水乙醇醇沉，Sevage 法脱蛋白，活性炭脱色，醇沉，乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤，干燥即得网地藻多糖的样品。

1.3.2 pNP 标准曲线的绘制

用蒸馏水准确配制系列浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L）的 pNP 标准溶液。精密吸取pNP 标准溶液 10 μL、pH 6.8 的磷酸盐缓冲液 90 μL、0.2 mol/L Na2CO3100 μL 于 96 孔板中，振荡混匀 30 s，测定其 405 nm 处吸光度（OD405），以 pNP 溶液浓度为横坐标，吸光度（OD405）为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3 网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

无色的底物PNPG 在α-葡萄糖苷酶作用下可水解释放出在碱性条件下显黄色的pNP，pNP 在405 nm处有最大吸收，因此通过测定405 nm 处的吸光度反应水解生成的pNP 浓度。参照文献[14]描述的方法，稍作修改，利用PNPG 为底物建立网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用体外模型。

一定质量浓度的网地藻多糖溶液按每孔50 μL 加入酶标板，每组设三复孔，另设药物对照孔、空白对照孔及空白反应孔。药物对照孔加50 μL pH 6.8 的磷酸缓冲液，药物反应孔加50 μL 的0.45 U/mL 酶振荡30 s 后于 37 ℃孵育 10 min，之后加 100 μL PNPG（5 mmol/L）振荡30 s 后 37 ℃反应 20 min，最后加 100 μL 0.2 mol/L Na2CO3终止反应，在 405 nm 处测定吸光度（OD）值，按下式计算网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率[15]。

式中：A1为药物反应孔吸光度值；A2为药物对照孔吸光度值；A3为空白反应孔吸光度值；A0为空白对照孔吸光度值。

1.3.4 网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用动力学试验

1.3.4.1 反应pH 值对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响

精确配制50 mg/mL 的网地藻多糖溶液按上述

1.3.3 的抑制作用测定方法，在温度37 ℃、反应时间20 min、反应pH 值（6.0、6.4、6.8、7.2、7.4）的条件下进行抑制作用测定，考察pH 值与抑制作用的关系。

1.3.4.2 反应温度对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响

精确配制50 mg/mL 的网地藻多糖溶液在1.3.4.1确定的反应pH 值条件下，在反应时间20 min，温度（27、32、37、42、47 ℃）的条件下按 1.3.3 的抑制作用测定方法进行抑制作用测定，考察反应温度与抑制作用的关系。

1.3.4.3 反应时间对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响

精确配制50 mg/mL 的网地藻多糖溶液，按1.3.3的抑制作用测定方法，在1.3.4.1 确定的反应pH 值条件下，在1.3.4.2 确定的反应温度下，在反应时间（10、20、30、40、50 min）的条件下进行抑制作用测定，考察反应时间与抑制作用的关系。

1.3.4.4 网地藻多糖质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响

取一定质量浓度的网地藻多糖溶液（1、5、10、15、20、25、30、40、50 mg/mL）按上述 1.3.3 的抑制作用测定方法，在1.3.4.1 确定的反应pH 值条件下，在1.3.4.2确定的反应温度下，1.3.4.3 确定的反应时间的条件下进行抑制作用测定，考察网地藻多糖的质量浓度与抑制作用的关系。

1.3.5 网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制类型试验

在1.3.4 优化的条件下，在网地藻多糖浓度（0、15、30 mg/mL），反应时间为6 min，测定网地藻多糖溶液在不同底物浓度（0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L）下对α-葡萄糖苷酶的酶促反应速率，以底物浓度倒数（1/[S]）为横坐标，反应速率倒数（1/V）为纵坐标，采用Lineweaver-Burk 双倒数作图分析，按式（2）（3）计算米氏常数Km和酶促反应最大速率Vmax，确定抑制类型[16]。

式中：V 为反应速率（μmol/L·min）；[S]为底物浓度（μmol/L）；Vmax为酶促反应最大速率（μmol/L·min）；Km为米氏常数（mmol/L）。

2 结果与分析

2.1 pNP标准曲线的绘制

pNP 标准曲线图见图1。

由图1 可知，在0.01 mmol/L～0.08 mmol/L 在范围内，吸光度与pNP 标准溶液的浓度与呈正相关，结果见图 1，其线性关系为：y=9.734 8x+0.223 4（R2=0.994 3）。根据绘制的标准曲线计算试验条件下所用α-葡萄糖苷酶的活力为0.45 U/mL。

图1 pNP 标准曲线图Fig.1 pNP standard curve

2.2 网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用动力学试验结果

2.2.1 反应pH 值对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响

每一种酶都有其作用的最佳pH 值，pH 值对酶活反应的影响较大。反应pH 值对抑制作用的影响见图2。

图2 反应pH 值对抑制作用的影响Fig.2 The effect of pH on inhibitory efficiency

由图2 可知，网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着反应pH 值的增加抑制率逐渐增强，当反应pH 值达到6.8 之后，抑制率逐渐减弱。每一种酶都有其作用的最适pH 值，α-葡萄糖苷酶作用最适pH 值偏中性，本试验确定的网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用pH 值为6.8，这与文献报道的一致[17]。

2.2.2 反应温度对网地藻多糖抑制作用的影响

反应温度对抑制作用的影响见图3。

由图3 可知，网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着反应温度的增加抑制率先增强后减弱，当反应温度达到37 ℃时，抑制率达到最大值，之后温度继续升高，抑制率却有下降趋势，可能是温度升高，酶的结构发生改变的原因。后续抑制作用试验的反应温度为 37 ℃。

图5 网地藻多糖质量浓度对抑制作用的影响Fig.5 The effect of inhibitor concentration on inhibitory efficiency

2.2.3 反应时间对网地藻多糖抑制作用的影响

反应时间对抑制作用的影响见图4。

图4 反应时间对抑制作用的影响Fig.4 The effect of reaction time on inhibitory efficiency

由图4 可知，网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着反应时间的增加抑制率逐渐增强，当反应时间达到20 min 之后，抑制率增加逐渐减慢，抑制曲线趋于平缓，可能是20 min 之后抑制剂与酶的作用已趋于饱和的原因。后续抑制作用试验的反应时间为20 min。

2.2.4 网地藻多糖质量浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

网地藻多糖质量浓度对抑制作用的影响见图5。

图3 反应温度对抑制作用的影响Fig.3 The effect of temperature on inhibitory efficiency

由图5 可知，网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着网地藻多糖浓度的增加抑制率逐渐增强，当网地藻多糖浓度达到40 mg/mL 之后，抑制率增加逐渐减慢，抑制曲线趋于平缓，可能是抑制剂与酶的结合已趋于饱和的原因。后续试验网地藻多糖溶液的质量浓度采用40 mg/mL。对除最后一点之外的点进行线性回归（以质量浓度为横坐标，抑制率为纵坐标）得回归方程为：y=2.164 3x+1.002 3（R2=0.991 4），计算其IC50约为：22.64 mg/mL。利用PNPG 为底物建立酶—抑制剂体外模型，在反应pH 值为6.8，反应温度为37 ℃、时间20 min 的条件下网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，有望将其开发为α-葡萄糖糖苷酶抑制剂。

2.3 网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制类型的确认

在网地藻多糖浓度（0、15、30 mg/mL），反应温度37 ℃，反应pH 值为6.8，反应时间为6 min 的条件下，测定网地藻多糖溶液在不同底物浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制情况。抑制作用的双倒数图见图6。

图6 抑制作用的双倒数图Fig.6 Double reciprocal plot of inhibition

由图 6 可知，在 3 个不同浓度（0、15、30 mg/mL）的网地藻多糖存在下，α-葡萄糖苷酶对PNPG 酶促反应的Lineweaver-Burk 双倒数作图呈线性关系，其直线为相交于第二象限的直线，该抑制类型属于混合型抑制[18]。网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数见表1。

由表1 的抑制动力学参数数据发现，随着网地藻浓度的不断增加，其抑制动力学参数Km逐渐增加，Vmax逐渐减少，这符合可逆的混合I 型抑制类型[19-20]。

表1 网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数Table 1 Kinetic parameters of alpha-glucosidase inhibited by Dictyota dichotoma polysaccharides

3 结论

研究表明，多糖是海藻中主要的生物活性成分，是一类分子量大、结构复杂的高分子天然化合物，因其来源于海洋，故具有其他天然多糖无法比拟的药理活性，受到广大学者的高度关注[21]。李龙[22]对坛紫菜多糖和龙须菜多糖的免疫调节功能进行了研究，结果表明这两种多糖均具有刺激免疫细胞分泌炎性因子的作用。邓志峰等[23]研究了龙须菜多糖和扁江蓠多糖的抗肿瘤活性，结果表明，这两种琼胶型多糖均能起到抑制肿瘤生长的作用。Zhang 等[24]研究了南海7 种海藻多糖的抗病毒活性，结果表明7 种海藻多糖对单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）和柯萨基病毒 B3（CoxB3）均表现出抗病毒活性。初步的文献检索发现，关于海藻多糖的药理活性的研究大都集中在抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫条件等方面，关于海藻多糖具有降糖药理作用的研究较少，本文在课题组前期研究的基础上[25]，采用对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（PNPG）为底物建立的酶-抑制剂体外筛选模型，研究了网地藻多糖的降糖作用。

网地藻多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的大小会受到反应pH 值、反应温度、反应时间及网地藻多糖质量浓度的影响，在反应pH 值为6.8、反应温度为37 ℃、反应时间为20 min 的条件下网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，其IC50为：22.64 mg/mL。抑制动力学试验表明网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为混合型抑制。结果表明网地藻多糖具有一定的降糖作用，其IC50约为：22.64 mg/mL。同等试验条件下，标准品阿卡波糖的IC50为：11.45 mg/mL[26]，虽然网地藻多糖的降糖作用达不到标准品阿卡波糖的降糖效果，但是网地藻在我国属于药食同源的海藻，可将其作为治疗或辅助治疗糖尿病的药物或保健品，为今后开发以网地藻多糖为主的药食两用型α-葡萄糖苷酶抑制剂提供理论依据，本文的研究结果还可为进一步开发广西北部湾海洋药用资源奠定基础。