裂叶荨麻醇提物体外抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

杨文娟，何亚娟，毛跟年，胡媛，侯景龙，马养民，龚频

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021；2.陕西科技大学化学与化工学院，教育部轻工助剂化学与技术重点实验室，陕西西安710021）

裂叶荨麻（Urtica fissa Pritz.）为被子植物门荨麻科（Urticaceae）荨麻属（Urtica Linn.）植物，该属植物在国内外广泛分布[1]，研究发现荨麻植株含有α 亚麻酸、亚油酸、叶黄素、β-胡萝卜素、蛋白质、维生素C、钙、硒及多种人体必需氨基酸，因此，其嫩茎叶常作为野生蔬菜用来凉拌、炒蛋、做汤等，具有极高的营养价值[2]。此外，荨麻属植物含有黄酮、木脂素、萜类、甾醇、多酚[3]等多种次生代谢产物，药理研究表明，其具有抗炎抗风湿、镇痛、抗氧化、降糖降脂、抗前列腺增生、抗肿瘤等活性[4]。

氧化损伤由生物体内自由基过量堆积引发，是导致生物衰老及诱发Ⅱ型糖尿病等相关代谢性疾病的重要原因[5-6]。具有抗氧化活性的物质可有效清除体内多余自由基，减少由活性物质引起的细胞氧化损伤，防止多种疾病的发生[7]。α-葡萄糖苷酶是位于小肠黏膜细胞刷状缘内的一组水解酶，其主要作用是促进肠道食物中碳水化合物如淀粉、蔗糖、麦芽糖等分解成单糖，从而引起餐后血糖升高。抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以减少单糖的生成，从而降低餐后血糖[8]，通过对α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测，可以初步判断药物有无降糖活性。

目前，已有文献报道荨麻属狭叶荨麻（Urtica angustifolia L.）、异株荨麻（Urtica dioica L.）的体外抗氧化[9]和降糖作用[10-11]，而裂叶荨麻的研究主要集中于化学成分[12]，体外抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究鲜有报道。本研究通过测定裂叶荨麻醇提物对DPPH 自由基、羟基自由基的清除率及总还原力来评价其体外抗氧化能力，通过α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究评价其对血糖的调节能力，以期为裂叶荨麻的进一步开发利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

裂叶荨麻原植物于2018 年8 月采自陕西省旬阳县，经陕西中医药大学颜永刚教授鉴定为荨麻科裂叶荨麻（Urtica fissa.Pritz.），植物标本保存于陕西科技大学药物制剂实验室。将裂叶荨麻全株阴干，置阴凉通风处存放。

无水乙醇、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、抗坏血酸（VC）、硫酸亚铁（FeSO4）、水杨酸、30 %过氧化氢（H2O2）、铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、无水碳酸钠（Na2CO3）、硝酸铝（Al（NO3）3）、氢氧化钠（NaOH）：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；亚硝酸钠（NaNO2）：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂；对硝基苯-α-D 葡萄糖吡喃苷（纯度为 90%，4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶（23.5 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、三氯化铁（FeCl3）：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（纯度为 99.6 %，1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）：上海笛医生物科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）：分析纯，上海山浦化工有限公司；芦丁标准品：纯度98.5 %，苏州天可贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-4 数显恒温水浴锅：金坛市江南仪器厂；JA26038 电子天平：上海天美天平仪器有限公司；TG16-WS 台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；XW-80A 涡旋混合仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；varioskan flash 全波长扫描式多功能读数仪：赛默飞世尔科技有限公司（芬兰）。

1.3 试验方法

1.3.1 裂叶荨麻醇提物的制备

参照文献[13]及预试验，取裂叶荨麻干燥茎适量，粉碎，过60 目筛，称取70 g 粉末，加入1 400 mL70%乙醇，70 ℃回流提取1 h，抽滤，滤渣重复上述步骤2次，合并2 次提取液，滤液于旋转蒸发仪减压浓缩至80 mL，浓缩液60 ℃水浴蒸干，4 ℃冷藏，临用前配制成所需浓度。

1.3.2 裂叶荨麻醇提物黄酮含量的测定

1.3.2.1 芦丁标准曲线的绘制

参照柴郑[14]的方法进行试验，分别取配制好的200 μg/mL 的芦丁标准液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 试管中，用甲醇补足5 mL 后分别加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.5 mL，摇匀放置6 min，然后再分别加入质量分数为10%的Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀放置6 min，最后加入质量分数为4%的NaOH 溶液4 mL，摇匀放置20 min，在500 nm 波长处测定其吸光度。同时分别设立5 支对照管，用于消除测定吸光度时药物本身背景颜色的影响。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2.2 裂叶荨麻醇提物中黄酮含量的测定

取裂叶荨麻醇提物0.015 g 于烧杯中加入少量甲醇超声溶解，溶解后转移至10 mL 容量瓶中定容，配成1.5 mg/mL 的溶液。采用与制定标准曲线中相同的显色方法进行显色，平行测3 次，在500 nm 波长处测定其吸光度值，同样设置对照管，消除药物本身颜色的影响。将测得的吸光度带入回归方程，计算裂叶荨麻醇提物中黄酮的含量。

1.3.3 体外抗氧化能力的测定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除活性

取DPPH 适量，加无水乙醇溶解配制成50 μg/mL的溶液。通过预试验确定VC及裂叶荨麻醇提物浓度均分别为 2、20、60、200、400、800 μg/mL。按范金波等[15]的方法在517nm 处测吸光度，全程严格避光操作，每个样品平行测3 次，按式1 计算DPPH 自由基清除率，并计算IC50。

式中：A对为对照组（100 μLDPPH+100 μL 无水乙醇）吸光度；A样为样品（100 μLDPPH+样品溶液）吸光度；A空为空白组（100 μL 样品+100 μL 无水乙醇）吸光度。

1.3.3.2 羟基自由基清除率的测定

采用水杨酸比色法测定，参照文献[16-17]稍作修改进行试验。

在 96 孔板中依次加入 50 μL 9mmoL/L FeSO4，50 μL 9 mmoL/L 水杨酸-乙醇溶液，50 μL 蒸馏水，50 μL 不同浓度的裂叶荨麻醇提物溶液，50 μL 8.8 mmoL/L H2O2，在510 nm 处测吸光度，每个样品平行测3 次。对照管用蒸馏水代替样品溶液，空白管用蒸馏水H2O2。按式2 计算·OH 自由基清除率，并计算IC50。

式中：A对为对照孔的吸光度；A样为样品孔的吸光度；A空为空白孔的吸光度。

1.3.3.3 总还原力的测定

参照许女等[18]的方法，取1 mL 样品溶液，加入2.5 mL 的 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.6）和 2.5 mL1 %K3[Fe（CN）6]于试管中混匀，50 ℃水浴中反应 20 min，迅速冷却并加入2.5 mL10%TCA，混匀后3 500 r/min离心10 min，取3 mL 上清液加入0.6 mL0.1%FeCl3混匀，再加3 mL 蒸馏水摇匀，以蒸馏水为空白对照，在波长700 nm 测定吸光度值。吸光度越大，总还原力越强。按式3 计算总还原力。

式中：A样为样品组的吸光度；A空为空白组的吸光度。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制试验

分为样品组、样品背景组、空白对照组、空白对照背景组，加入的试剂按表1 操作。加入样品与α-葡萄糖苷酶后37 ℃反应10 min，再加入PNPG（1 mmoL/L）37 ℃反应30 min，最后加入100 μL Na2CO3（1 moL/L）终止液终止反应[19]，在405 nm 波长处测定吸光度。按式4 计算α-葡萄糖苷酶的抑制率，并计算IC50。

表1 裂叶荨麻醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定的加样表Table 1 A sample of the determination of α-glucosidase inhibitory activity by the extract of Urtica

式中：A1为样品背景组吸光度；A2为样品组的吸光度；A3为空白对照组吸光度；A4为空白对照背景组吸光度。

1.4 数据处理

采用origin 8.0 及SPSS 24.0 对数据进行分析，结果以均数±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 裂叶荨麻醇提物中总黄酮含量测定结果

以芦丁的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图1 所示。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standrad curve of rutin

由图1 可知，标准曲线方程为y=10.61x-0.008 6，R2=0.995 5，说明芦丁在 100 μg/mL～500 μg/mL 质量浓度范围内与吸光度具有良好的线性关系。试验测得裂叶荨麻醇提物中黄酮的含量为12.09 mg/g。

2.2 裂叶荨麻醇提物体外抗氧化测定结果

2.2.1 裂叶荨麻醇提物对DPPH 自由基的清除能力

裂叶荨麻醇提物对DPPH·的清除率如图2 所示。

图2 DPPH 自由基清除能力Fig.2 DPPH·free radical scavenging capacity

由图2 可知，裂叶荨麻醇提物（IC50=9.960 μg/mL）对 DPPH 自由基的清除率与 VC（IC50=1.870 μg/mL）的趋势基本一致。在0～100 μg/mL 范围内裂叶荨麻醇提物对DPPH 自由基的清除率随浓度增加的趋势较快，在100 μg/mL～800 μg/mL 范围内随浓度增加的趋势较为缓慢，达到最大值后趋于稳定，最大值可达92.76%，VC对DPPH 自由基的最大清除率为98.61%。由此可以看出，裂叶荨麻醇提物对DPPH 自由基的最大清除率与VC相近，但达到最大清除率时所需浓度是VC的8 倍左右。

2.2.2 裂叶荨麻醇提物对羟基自由基的清除能力

裂叶荨麻醇提物对·OH 的清除率如图3 所示。

图3 羟基自由基（·OH）清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity

由图3 可知，裂叶荨麻醇提物（IC50=1.123 mg/mL）对·OH 的清除率与VC（IC50=10.302 μg/mL）的趋势基本一致。在0～4 mg/mL 范围内对·OH 的清除率随浓度的增加基本上呈线性关系，在4 mg/mL～10 mg/mL 范围内，对·OH 的清除率随浓度增加的趋势较为平缓，最大值可达98.05%，VC对·OH 的最大清除率为97.39%，裂叶荨麻醇提物对·OH 的最大清除率与VC基本一致，说明裂叶荨麻醇提物具有较强的·OH 清除能力。

2.2.3 裂叶荨麻醇提物总还原力测定结果

裂叶荨麻醇提物的总还原能力测定结果如图4所示。

图4 总还原能力Fig.4 The total reducing power

裂叶荨麻醇提物与VC对Fe3+的还原力结果由图4可知，在一定范围内裂叶荨麻醇提物与VC的还原力都是随着浓度的增加而增加，有一定的量效关系，但是在与VC浓度相同时的还原力为VC的5%左右，可能是由于VC是纯净物，而裂叶荨麻提取物中所含化学成分较多，除黄酮外的其他成分影响了总还原力。

2.3 裂叶荨麻醇提物α-葡萄糖苷酶抑制活性测定结果

α-葡萄糖苷酶抑制剂能减少淀粉类分解为单糖的速度，从而降低餐后血糖。裂叶荨麻醇提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用如图5 所示。

图5 裂叶荨麻醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.5 Inhibitiory effect of extract of Urtica on α-glucosidase

α-葡萄糖苷酶能将淀粉分解为葡萄糖，竞争性抑制其活性可以减少葡萄糖的生成，从而降低血糖值。由图5 可知，裂叶荨麻醇提物对α-葡萄糖苷酶的抑制率在0～40 mg/mL 范围内随浓度的增大而升高，大于40 mg/mL 后抑制率随浓度上升的较为缓慢。在试验所选浓度范围内，裂叶荨麻醇提物对α-葡萄糖苷酶的最大抑制率为59.06%，表明裂叶荨麻醇提物对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，提示裂叶荨麻醇提物可能有降糖作用。

3 结论

本文测定了裂叶荨麻醇提物中总黄酮的含量，并对其体外抗氧化作用及对α-糖苷酶的抑制作用进行了研究。经测定，裂叶荨麻醇提物中总黄酮含量为12.09 mg/g，表明醇提物含有一定量黄酮，而已有文献报导黄酮类化合物具有清除自由基的作用[20-21]。体外抗氧化结果表明，裂叶荨麻醇提物对DPPH 自由基的最大清除率为 92.76 %，IC50值为 1.123 mg/mL，VC对DPPH·的最大清除率为 98.61%，IC50值为 1.870 μg/mL；裂叶荨麻醇提物对羟基自由基的最大清除率为98.05%，IC50值为 1.123 mg/mL，VC对·OH 的最大清除率为97.39%，IC50值为 10.302 μg/mL，裂叶荨麻醇提物与VC的总还原力均随醇提物浓度的增加而增强。由试验数据可以看出当裂叶荨麻醇提物浓度升高到一定程度时，对DPPH 自由基及羟基自由基的最大清除率能达到与VC相同的效果，但在相同浓度下，清除率低于VC，总还原力随着浓度的增加而增加，相同浓度时的还原力为VC的5%左右。α-糖苷酶的抑制作用能够影响糖代谢，在本研究所选浓度范围内裂叶荨麻醇提物对α-糖苷酶的最大抑制活性为59.06%，IC50值为31.598 mg/mL。说明裂叶荨麻有一定的抑制α-糖苷酶的能力。本课题组经前期研究表明，裂叶荨麻对糖尿病小鼠的肝脏及肾脏损伤具有保护作用，对血糖指标也有改善[22-23]，结合体外α-糖苷酶抑制测定结果，说明裂叶荨麻醇提物具有降糖活性，可能与抑制糖苷酶有关。由此可以看出，裂叶荨麻醇提物具有一定的抗氧化能力及抑制α-糖苷酶活性的能力，药效物质基础可能与黄酮类化合物有关，本研究为体内的抗氧化及降糖研究提供了理论依据，为裂叶荨麻的进一步加工应用提供了新途径。