结核分枝杆菌Rv2660c蛋白原核重组表达及其免疫活性研究

孙卫国 曹志红 李改平 杨秉芬 刘艳华 贺雄 张灵霞

传统的结核病诊断方法存在较大局限性，如抗酸染色敏感性低，而作为结核病诊断金标准的结核分枝杆菌培养则耗时较长，影响了结核病的早期诊断。结核病血清学诊断虽然具有快速特点，但所用的抗原仍然局限于38kD蛋白、16kD蛋白、ESAT-6、CFP-10等少数几种，并且单独用于结核病临床诊断效果较差。另外，很大一部分人群处于结核分枝杆菌潜伏感染(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)状态，临床上目前还没有成熟的LTBI诊断和检测方法。结核病的防控需要开发新的诊断方法去鉴别并阻止潜伏感染患者发展成活动性结核病(Tuberculosis，TB)[1]，目前以细胞免疫为基础的结核分枝杆菌γ干扰素释放试验(interferon γ release array,IGRA)已经获得快速发展并进入临床应用。这种检测方法目前以T-SPOT，TB和QuantiFEron-TB Gold 试剂盒为代表，能区分结核分枝杆菌感染与BCG接种，适用于我国BCG广泛接种的地方[2]。实验室研究中有诸多 LTBI 相关蛋白结构和功能的报道，成为LTBI机制研究热点，并有望应用于LTBI 的诊断。结核分枝杆菌Rv2660c和Rv2659c蛋白为BCG RD11区缺失抗原，是一类LTBI相关蛋白。体外低氧或营养缺乏环境下培养结核分枝杆菌，发现Rv2659c和Rv2660c这两种蛋白基因的表达呈上调趋势[3]；同时研究发现，在135株M.TB临床分离株中，Rv2660c未发现突变，它的基因序列比较保守[4]。Rv2660c蛋白刺激结核分枝杆菌潜伏感染者外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)释放IFN-γ水平明显高于健康人群对照组[5]，这些都提示Rv2660c在潜伏感染状态下机体免疫调节和保护潜伏感染过程中扮演着重要的角色。

鉴于Rv2660c蛋白在结核分枝杆菌中的作用和结构、功能特点，本课题采用成熟的原核表达系统获得重组Rv2660c蛋白，以Western-Blot 实验验证该重组蛋白的抗原性，同时以ELISA 实验评价其在血清学方面用于区分活动性结核病与潜伏感染是否具有诊断价值，本实验为进一步研究该重组Rv2660c蛋白的干扰素-γ释放试验，分析其在潜伏感染实验室诊断上的可行性 ；同时为研究 Rv2660c 在结核分枝杆菌内的功能和结核分枝杆菌在饥饿状态下免疫逃逸和潜伏感染等分子奠定基础。

资料与方法

一、材料

1 研究对象 50例确诊菌阳肺结核患者血清与50例菌阴肺结核患者血清由本室临床实验室鉴定收集提供，患者中男性60例，女性40例，年龄22～52岁，平均(35.6±15.2)岁，患者经临床表现、体征、胸部CT及实验室诊断结果确诊为肺结核，且无同时患有其它呼吸类疾病；菌阳患者为结核分枝杆菌培养阳性，菌阴患者为结核分枝杆菌培养阴性；30例干扰素-γ 释放试验阳性的健康人(定义为潜伏感染者)血清本室收集保存，患者中男性15例，女性15例，年龄18～60岁，平均(33.2±16.3)岁；30例干扰素-γ 释放试验阴性的健康人血清由本院体检中心提供，患者均为男性，年龄18～40岁，平均(23.2±14.6)岁。干扰素-γ 释放试验采用上海铭源数康生物芯片有限公司的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫斑点法)，具体操作见说明书。

2 质粒、菌株和血清 质粒pET-28a、E.coli DH5a、表达菌种BL21(DE3)系本室保存，其感受态细胞由本室制作。

3 仪器与试剂 Rv2660c蛋白全基因和引物由华大基因公司合成， NdeI(批号：0290201)与 XhoⅠ(批号：0581503)、T4 DNA连接酶(批号：0021012)购自NEB公司(美国)；PCR试剂来自天根生化生物公司(国产)；酶标羊抗人IgG购自华美生物技术公司；亲和树脂填料购自美国GE公司，本室装填纯化柱、蛋白质相对分子质量marker (美国sigma公司)；其它试剂为进口或国产分析纯。

二、方法

1 Rv2660c 全基因与引物合成 通过NCBI查Rv2660c 的Gene ID: 887222，全基因共228个碱基.进行全序列合成，在5′ 和3′ 端分别引入NdeI(CATATG)和XhoⅠ( CTCGAG)酶切位点 ，在3′ 端加入原核表达系统偏爱终止密码子TAA。合成全序列为：catatggtgatagcgg gcgtcgacca ggcgcttgca gcaacaggcc aggctagcca gcgggcggca ggcgcatctg gtggggtcac cgtcggtgtc ggcgtgggca cggaacagag gaacctttcg gtggttgcac cgagtcagtt cacatttagt tcacgcagcc cagattttgt ggatgaaacc gcaggtcaat cgtggtgcgc gatactggga ttgaaccagt ttcac taactcgag

合成的阳性克隆筛选鉴定引物为： 正向引物 5-ccccatatggtgatagcgg -3, 反向引物 5-ccgctcgagttagtgaaactgg-3

2 pET28a - Rv2660c 表达载体的构建 利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ对华大基因公司提供Rv2660全序列阳性克隆质粒pUC19- Rv2660c进行双酶切获得大小约230bp大小的核酸片段，然后与同样双酶处理的表达载体pET28a进行连接，连接产物转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆，获得表达工程菌 pET28a - Rv2660c。

3 Rv2660c 融合蛋白的原核表达与纯化 将阳性工程菌株转接至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡培养，监控细菌生长A600 值，当OD值为0.5时加入IPTG至终浓度为0.3mmoL，37℃继续诱导7h，离心收集菌体，在冰浴状态下进行超声破碎。4℃条件下高速离心后(12000rpm, 30分钟)，取上清和沉淀进行 SDS-PAGE 电泳分析重组蛋白的表达形式。重组蛋白N端携带6个组氨酸标签，通过镍离子螯合的亲和层析柱对目的蛋白进行亲和纯化，分别以50mmoL咪唑除去菌体自身杂蛋白、150 mmoL咪唑洗脱收集重组，以15% SDS-PAGE鉴定纯化后蛋白纯度。

4 重组Rv2660c蛋白Western-Blot与ELISA实验分析 将纯化的重组Rv2660c蛋白干粉用PBS缓冲液配制成1mg/mL的母液备用，取 2μL加入载样Buffer煮沸10min后行SDS-PAGE，半干法电转到硝酸纤维素膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭2小时，分别以确诊菌阳结核病患者、菌阴结核患者、潜伏感染者和健康人对照血清37℃孵育2小时，PBST缓冲液洗涤后、以HRP标记的羊抗人IgG 37℃孵育1小时，漂洗干净，过ECL暗室自动曝光显影，分析该重组蛋白的抗原性。

以碳酸钠盐溶液将纯化的重组Rv2660c蛋白进行稀释，终浓度为6μg/mL，往96孔酶标板每孔加入100μL重组蛋白包被液，包被过夜，次日37℃条件下用5%的脱脂奶粉封闭2h，用PBS-Tween(0.05%)洗板5次，将菌阳结核病患者组、菌阴结核患者组、潜伏感染者组和健康人对照组血清用PBST按1 ∶20进行稀释，每孔100μL分别加入包被孔和对照孔，于37℃孵育1h，重新洗板若干次，每孔再加入用 PBST按1 ∶1000 稀释的HRP标记的羊抗人IgG 100μL，37℃震荡孵育30min，再洗板5次，加TMB色底物，100μL/孔，室温避光反应30min，每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应。酶标仪检测450m波长处的A值,分析结果。

5 统计方法 用健康人的平均OD值加上2.576倍的其标准差(SD)作为cutoff( 即cutoff=meanhealthy+2.576×SD)来计算重组Rv2660c蛋白的检出率和特异性[6]。

结 果

一、pET-28a-Rv2660c表达载体构建

将合成的 Rv2660c 核酸序列通过分子克隆技术插入到 pET-28a 表达载体上，采用菌落PCR的方法进行鉴定，1%的琼脂糖核酸电泳显示扩增片段大小在230bp左右，与预期值相符(图1)。将阳性克隆送华大基因公司测序，测序结果证实构建成功。

图1 Rv2660c核酸PCR鉴定凝胶电泳鉴定结果

M.marker DNA2000 1，3，5.重组Rv2660c阳性克隆；2，4.重组Rv2660c阳性克隆

二、重组Rv2660c融合蛋白表达与纯化

重组Rv2660c工程菌经IPTG诱导后可获得目的蛋白的原核表达，经过冰浴超声破碎后，SDS-PAGE电泳发现，在目的分子量10.2KD处有明显的蛋白表达，箭头所示，其中超声破碎上清和沉淀各占50%左右(图2)。

图2 重组Rv2660c蛋白表达SDS-PAGE分析

M.低分子量蛋白标准 1.无诱导对照 2.超声后上清 3.超声后沉淀

表达上清以亲和层析纯化后，150mmol咪唑洗脱液获得的纯化蛋白纯度在85%左右(图3)。

图3 重组Rv2660c蛋白亲和纯化SDS-PAGE分析

M.低分子量蛋白标准 1.低浓度咪唑洗脱的杂蛋白； 2.亲和纯化的重组Rv2660c蛋白

三、重组Rv2660c蛋白Western Blot实验结果

将菌阳结核病患者、菌阴结核病患者、潜伏感染者以及健康对照者的血清分别与重组蛋白进行印记实验，实验结果(见图4)。活动性结核患者(包括菌阳患者和菌阴患者)的血清抗体能与获得的重组蛋白发生抗原抗体反应，出现一条明显的杂交条带；而潜伏感染者和健康对照者的血清没有出现杂交条带。表明活动性结核患者体内存在抗Rv2660c蛋白特异性抗体，潜伏感染者和健康对照者体内不存在抗Rv2660c蛋白特异性抗体或抗体的滴度很低。

图4 重组Rv2660c蛋白与各类血清Western Blot结果

四、重组Rv2660c蛋白ELISA试验结果

以重组纯化获得的 Rv2660c 蛋白为包被抗原，应用 ELISA方法检测各组人群血清中Rv2660c特异性抗体水平。结果(见表1)。

表1 ELISA检测各组人群血清中 Rv2660c 特异性抗体结果组间比较

经Kolmogorov-Smirnov正态性检验，四组P分别等于0.714、0.407、0.660、0.848，认为所有四组数据均为近似正态分布。然后进行ANOVA检验，方差齐性检验，P值等于0.141，认为方差具有齐性。四组均数比较F=374.209，P=0.0，差异具有统计学意义。然后对组间均数进行两两比较，每两组之间P值均<0.01，差异均有统计学意义。

重组蛋白与活动性结核病患者血清无论是菌阳性还是菌阴性均发生较强的免疫反应性，二者无显著区别，P>0.05；它们的A450吸光值明显高于潜伏感染组或健康对照组(P<0.05)；而潜伏感染组与健康组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

根据试剂盒说明书，设置cutoff为 meanhealthy+2.576×SD，重组蛋白检测结核病人的阳性检出率为61%，特异性为95.3%，检测潜伏感染者血清的敏感性为21.6%，特异性为95.3%。结果证实重组Rv2660c蛋白对于活动性结核病的诊断具有较强的特异性，用于活动性结核病血清学诊断有一定价值，但相对于潜伏感染患者血清学诊断而言，不具有诊断作用。

讨 论

寻找特异性血清学诊断抗原或者融合肽曾经是结核病临床诊断挖掘的方向，但目前敏感抗原还局限于38kD、ESAT-6、CFP-10等少数几种，虽然它们的特异性都能满足临床需求，但敏感性较低，无法进行广泛的应用。新型的干扰素-γ释放试验通过检测结核分枝杆菌特异性抗原刺激T淋巴细胞产生的IFN-γ来判断是否存在结核分枝杆菌感染，目前这种方法已经用于结核病患者的临床诊断，同时，这种干扰素-γ释放试验也开始用于LTBI的辅助诊断[7]，目前用于干扰素-γ释放试验结果较好的仍然是结核分枝杆菌RD1区编码特异性抗原ESAT-6和CFP-10，它们可以区分BCG接种和结核分枝杆菌感染，与结核菌素试验相比有更高的灵敏度和特异度[8]。结核病的临床诊断需要新型结核分枝杆菌特异性抗原去提高诊断的敏感性，也需要新的特异蛋白鉴别活动性结核和潜伏感染。随着研究的深入，一部分结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白结构、功能和潜伏感染相关性被逐渐认知，实验室有望利用结核分枝杆菌潜伏感染相关抗原的功能作用建立起筛选结核分枝杆菌潜伏感染的诊断方法。Voskuil等[9]通过在体外缺氧的环境下培养结核分枝杆菌，检测发现其中50个基因的表达上调，这些基因涉及到细菌细胞壁的合成、代谢和无氧呼吸等，它们被认为与结核分枝杆菌潜伏感染有关。

结核分枝杆菌Rv2660c也是一种潜伏感染相关蛋白，与结核分枝杆菌营养代谢有关，是饥饿刺激(Starvation stimulon)相关蛋白，环境营养缺乏时其表达上调，理论上可用于结核分枝杆菌潜伏感染的诊断研究。通过生物信息学研究发现，Rv2660c与人类蛋白的同源性仅为16%，和BCG菌体蛋白重复序列也较少，氨基酸序列保守，具有丰富的T细胞和B细胞抗原表位，抗原预测分值为0.9073，适合作为抗原进行疫苗研发或者诊断研究[10]。本实验通过原核重组的方法获得Rv2660c蛋白，分别将菌阳结核病患者、菌阴结核病患者、潜伏感染者以及健康对照者的血清分别与重组蛋白进行印记实验，实验结果表明活动性结核病患者(包括菌阳患者和菌阴患者)的血清抗体能与获得的重组蛋白发生抗原抗体反应，出现一条明显的杂交条带；而潜伏感染者和健康对照者的血清没有出现杂交条带。说明活动性结核患者体内存在抗Rv2660c蛋白特异性抗体，潜伏感染者和健康对照者体内不存在抗Rv2660c蛋白特异性抗体或抗体的滴度很低。同时血清ELISA实验表明菌阳结核病患者组、菌阴结核病患者组、潜伏感染组以及健康对照组A450平均值分别为0.52±0.21、0.48±0.16、0.28±0.14 和0.25±0.17。重组蛋白检测结核病人血清的阳性检出率为61%，特异性为95.3%；检测潜伏感染者血清的阳性检出率为21.6%，特异性为95.3%。实验结果表明重组Rv2660c蛋白对于活动性结核的诊断具有较强的灵敏度和特异性，但对潜伏感染的诊断没有价值。也说明单独某一结核分枝杆菌重组抗原虽然具有良好的免疫反应性，但在血清学诊断应用上很难达到满意的结果，同时，相对活动性结核病和潜伏感染状态，通过血清学实验进行区分也几无可能。推测Rv2660c蛋白可能只在结核分枝杆菌活动或特定的环境下(比如结核分枝杆菌饥饿状态下)通过上调表达抑制菌体某些代谢相关基因的功能，激发宿主提高体液免疫应答，而在潜伏感染稳定的状态下，结核分枝杆菌处于休眠不复制的平衡状态，Rv2660c蛋白不再表达，而结核分枝杆菌休眠前Rv2660c蛋白在宿主体内产生的特异性抗体逐渐被稀释或降解。机体免疫有记忆性，用重组Rv2660c蛋白刺激潜伏感染者的淋巴细胞，理论上会释放干扰素-γ。实验后期将以重组Rv2660c蛋白开展干扰素-γ释放试验，分析其在潜伏感染实验室诊断上的可行性，同时进行结核分枝杆菌在饥饿状态下免疫逃逸和潜伏感染相关机制研究。