MicroRNAs 参与慢性阻塞性肺疾病发病机制的研究进展

彭玲 综述 周超 审校

引 言

一、慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease COPD)俗称慢阻肺，最早由 Briscoe等在“慢性支气管炎、肺气肿、哮喘”的基础上提出，将其定义为一种以持续气流受限为特征的，可以预防和治疗的疾病[1]。临床上主要以异常的慢性气道炎症、小气道重塑、肺泡破坏为病理特征。

二、MicroRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNA,一般由 18～25个核苷酸组成，可通过抑制信使RNA(mRNA)的翻译或诱导其降解而影响调控机体几乎所有的生物过程。据统计，miRNAs调控人体几乎60%的基因[2]。以往研究发现miRNAs在由单核细胞向多核细胞进化前就已出现，其产生可通过膜囊泡包裹主动分泌、蛋白miRNAs复合体及脂蛋白复合体主动分泌、外泌体主动分泌、细胞凋亡裂解后被动分泌[3]。此外，人们普遍认为miRNAs不仅可在某一特定的细胞或组织中起作用，而且可在细胞外囊泡(ExtracellularVesicles, EVs)中活跃地转运。EVs是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成分，包括外泌体、微囊泡、凋亡小体等组分，可来源于几乎所有细胞类型(如上皮细胞源性EVs、巨噬细胞源性EVs、内皮细胞源性EVs等)。因miRNAs可广泛且稳定地存在于血清、血浆、关节液、唾液等体液中[4-5]。现阶段研究已证实miRNAs主要通过与靶基因 mRNAs结合抑制其翻译或促进其降解，对机体 mRNA的稳定及翻译效率起重要调节作用。目前的诸多研究表明，miRNAs可通过多种途径参与慢阻肺的发生与发展(见图1)。

MicroRNAs与慢阻肺的病理生理

一、miRNAs与烟雾暴露

烟雾暴露是目前公认的与慢阻肺发病相关的主要危险因素之一，经研究证实，重度吸烟人群，慢阻肺的发病率是不吸烟人群的5倍。首先烟雾吸入会刺激肺上皮细胞，导致促炎细胞因子的释放，从而引发先天和获得性炎症反应(innate and adaptive inflammatory responses)。其次，烟雾刺激肺部炎症反应，可增加机体活性氧(ROS)的产生，从而促进与慢阻肺有关的病理生理变化，这最终将导致鳞状化生、成纤维细胞活化、粘液产生和气道重塑[4]。

目前，包括miRNAs在内的表观遗传学机制已受到广泛学者的关注，其中组蛋白乙酰化和去乙酰化是基因转录的关键调节因子，若两者表达失衡，则易导致吸烟者慢阻肺人群的基因表达谱发生改变。Stolzenburg LR等人也发现吸烟者肺中miR-223升高，而miR-223表达的升高与组蛋白去乙酰化酶 2(HDAC 2)表达降低有关，HDAC 2活性的降低会导致炎症和皮质激素抵抗的扩大化。同时他们还发现吸入香烟烟雾后，呼吸道组织样本中的miR-101也有所增加[4,6]。Graff JW 等比较吸烟者与不吸烟者肺泡巨噬细胞miRNAs的表达情况后发现，吸烟者肺泡巨噬细胞中有包括 miR-132、miR-139 在内的11个 miRNAs的表达升高，有包括 miR-452、miR-129-3p在内的 43 个 miRNAs表达降低。这种差异性表达，提示我们 miRNAs可能在慢阻肺的发生发展及表观遗传机制中存在潜在的致病作用[7]。

另一项关于健康受试者、吸烟无症状者及慢阻肺患者体内miRNAs表达差异的实验研究数据表明，在慢阻肺患者和无症状吸烟者中,血清miR-21的表达水平明显升高，而miR-181a的表达水平则明显下降。并推测 miR-21与 miR-181a的比值升高可作为重度吸烟者罹患慢阻肺的早期诊断标志[8]。此外，有研究发现慢阻肺吸烟患者痰中let-7c靶基因(肿瘤坏死因子受体II 型(TNFRII))表达增加，且与let-7c表达呈负相关，并证实烟草提取物可引起人支气管上皮细胞中miR-200c表达的下调，诱导人支气管平滑肌细胞 miR-7表达及miR-135b过表达，参与体内炎症反应的发生[9-10]。一项基于烟雾暴露小鼠戒烟前后miRNAs变化趋势的研究发现，烟雾诱导的 miRNAs变化是剂量依赖性的，且只有部分miRNAs可逆，大多无法恢复到基础水平，比如 miR-34b、miR-345、miR-421、miR-450B、miR-466 和 miR-469在戒烟1周后均未出现明显改变[11]。因此，miRNAs谱的变化可能与烟雾暴露所致的肺组织损伤和炎症程度相关。

以上多项研究结果表明，烟雾暴露与体内miRNAs的差异表达密切相关，然而有趣的是，miRNAs不仅调控正常的基因表达，还越来越多地被发现参与表观遗传机制。进一步对miRNAs与表观遗传学联系的研究也发现，miRNAs 与经典表观遗传学机制(如DNA 甲基化与去甲基化、组蛋白乙酰化与去乙酰化)之间存在复杂的相互作用，最新的研究亦证实在慢阻肺患者血液、痰和肺组织中，DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNAs都存在明显的异常表达，提示miRNAs具有调节表观遗传机制的潜力[10]，或许可作为吸烟患者罹患慢阻肺的早期预测因子。然而就目前研究可知，戒烟虽可以延缓疾病的发展，但现在还没有治愈慢性阻塞性肺疾病的方法，而且目前的药物也无法逆转长期的肺功能下降。所以，进一步研究miRNAs和表观遗传机制之间复杂的相互作用及其在体液、组织中的改变或许能够提示慢阻肺患者吸烟剂量并作为罹患或预后的预测因子。

二、miRNAs与炎症反应

小气道持续且过度的炎症反应是慢阻肺的主要病理特征之一。正常生理情况下，机体对外界的有害物质或有害气体的刺激会产生适当的炎症反应(一种保护性反应)，而在这种适当的平衡状态中，反馈调节的存在至关重要。近年来随着人们对于miRNAs探索发现，miR-135可通过3'UTR降低白介素-1 受体(IL-1R)的表达和抑制白介素-1(IL-1)信号传递靶点参与机体炎症反应的负反馈调节机制[2]。

为进一步了解miRNAs与炎症反应的关系，一项转染 miR-21的 T细胞亚群的研究发现， miR-21的转染可导致肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)表达上调，加重机体炎症反应[6]。此外，miR-218可与肿瘤坏死因子受体1(TNF-R1)的3'UTR结合，阻断TNF-R1 所诱导的 IL-6、IL-8的释放及核转录因子kappa B(NF-κB)活性增强而减轻毛细支气管炎症反应。miR-146也被证实参与 NF-κB 信号通路的调控，当 miR-146低表达时， NF-κB 过度活化，导致环氧化酶-2(COX-2)半衰期延长，降解减少，(COX-2 是前列腺素E2(PGE2)生物合成的关键酶，而 PGE2 是中性粒细胞合成的启动子)中性粒细胞产生增多， 从而导致炎症反应的不平衡化[12]。Park H 等人也证实 miR-146a和 miR-146b的过表达可靶向作用于 TRAF 6 和 IRAK 1蛋白，从而抑制炎症细胞因子(如 IL-12p70、IL-6、TNF-a 和 IFN-g)的分泌[13]。

正常情况下，人体在发生炎症时，炎症因子可通过Toll样受体 4(TLR4)信号通路，激活凝脂酰基醇激酶3(PIK3)，将蛋白激酶 B(PKB)磷酸化为磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PAKt)从而抑制miR-199的表达。而过度的炎症刺激则会抑制机体TLR4信号通路，导致 miR-199表达上调，由此我们猜测miR-199或许可作为炎症反应强度的预测因子[14]。MiR-181c的高表达被证实可通过靶向富半胱氨酸肝素结合蛋白61抗体(CCN1),减轻机体炎症反应，减少中性粒细胞的浸润，减少活性氧的生成，提示其很有可能作为靶向治疗的目[2]。

因此，miRNAs 可通过多种途径参与慢阻肺患者炎症反应的调节过程，这将为我们提供靶向改善机体异常炎症反应的切入点。

三、miRNAs与气道重塑

气道重塑是机体在反复炎症刺激下气管壁的自我修复功能紊乱的结果，主要以小气道重塑为主，进而出现管腔狭窄，气流受限。目前研究显示气道重塑的主要机制包括以下几个方面：蛋白酶-抗蛋白酶失衡、自身免疫机制、氧化应激、气道平滑肌功能失调[15-16]。

α1-抗胰蛋白酶是一种广谱的蛋白酶抑制剂，对炎症反应有一定的限制作用。研究发现，慢阻肺患者血清中miR-132和miR-212表达上调，而α1-抗胰蛋白酶mRNA与miR-132、miR-212的表达呈负相关，表明α1-抗胰蛋白酶mRNA为 miR-132、miR-212的作用靶点[17]。SMAD是TGF-β超家族成员信号转导过程中的关键分子，与气道平滑肌增殖和气道重塑关系密切。miR-145已被证明不仅具有调节肌成纤维细胞分化和肺纤维化的作用，还可负向调节并释放前炎细胞因子，前炎细胞因子可通过促发慢性阻塞性肺病患者气道平滑肌细胞中SMAD3的释放，从而加速气道重塑[12]。而miR-23b可通过 TGF-β2、磷酸化SMAD3(PSMAD3)等信号通路调控 TGF-β1 所诱导的气道重塑，即 miR-23b可负反馈调节 TGF-β2，抑制气道重塑[17]。此外，一项敲除 miR-155的小鼠实验发现，miR-155的缺失会导致B淋巴细胞、T淋巴细胞的反应丧失，以及辅助性T细胞向Th2型细胞分化缺失，表现为免疫缺陷和大量气道重塑，加快慢阻肺患者病情的发展[18]。研究发现miR-145可参与平滑肌细胞的分化、可塑性、表型分化，参与嗜酸性粒细胞炎症的调节及过敏性气道炎症性疾病粘液的分泌调节。miR-145的高表达可促进α-平滑肌蛋白(α-SAM)的表达，增强肺成纤维细胞的收缩能力，促进局部纤维粘连，而miR-210可通过自噬和促进肌成纤维细胞分化促进气道重塑，相反，miR-438-5p可能具有逆转 TGF-β介导的肺上皮细胞和成纤维细胞增殖的作用[19]。同样有趣的是，miR-21过表达亦可促进气道平滑肌细胞(ASM)增殖与迁移，加速病情进展，而MiR-138可抑制ASM细胞增殖与迁移，缓解病情进展[17]。所以，miRNAs即可作为疾病发生发展的始动者，又可作为抑制其发生发展的保护者，在疾病的诊治和预防方面值得我们进行更深一步的探索。

图1 miRNAs表达谱在慢阻肺各病理生理过程中的差异性表达。长期烟雾刺激导致支气管异常炎症反应，持续的炎症刺激及组织异常修复可导致小气道狭窄及气流受限，最终形成肺气肿，当细菌或病毒入侵时可诱发慢阻肺急性加重。

四、miRNAs与肺气肿

肺气肿主要以肺泡组织的破坏、丢失以及肺泡弹性回缩力的降低为病理表现。目前对其 发病机制还不明确，大多学者认为其发生发展与机体蛋白酶-抗蛋白酶失衡关系密切，且目前研究发现，miRNA的异常表达与肺气肿的严重程度密切相关。

一项 Spiral与 H合作的研究显示，有63种 miRNAs的异常表达与肺气肿严重程度相关， 其中 miR-638,miR-30c、miR181d被认为是最具相关性的靶基因。另一项探讨miRNAs在 慢阻肺患者肺气肿性肺破坏的特殊作用的研究指出，miR-638可促进肺气肿肺组织和肺纤维瘤的成熟，进一步研究也证实，miR-638具有至少 50个靶点参与肺气肿的调控[20]。miR-34可抑制 慢阻肺患者CD80和 CD86的表达及干扰素-α(INF-α)的分泌，从而影响SERPMΕ1蛋白酶抑制剂的表达，参与机体蛋白酶-抗蛋白酶失衡，影响肺气肿的严重程度[21]。miR-452被发现其表达与其预测靶点基质金属蛋白酶(MMP)-12的表达呈负相关，而(MMP)-12被认为是肺气肿发生发展的重要机制之一，由此可知 miR-452与肺气肿严重程度密切相关[22]。

此外，慢阻肺患者长期存在缺氧现象，导致体内氧化应激反应增强，P53表达上调，进而导致 miR-199上调，抑制缺氧诱导因子-α(HIF-α)表达，血管内皮生长因子(VEGE)生成减少，从而导致肺的持续性损害[2]。Ezzie ME等证实 miR-15b可通过抑制 TGF-β1下调重度肺气肿患者中成纤维细胞蛋白多糖的表达而抑制肺气肿的发展[23]。以上结果提示 miRNAs或许可作为减缓肺气肿发生发展的切入点，为我们临床治疗提供新的方向。

五、miRNAs与慢性阻塞性肺疾病急性加重 (AECOPD)

对于慢性阻塞性肺疾病患者来说，急性加重是导致患者病情恶化甚至死亡的主要原因之一，遗憾的是，到目前为止，我们还没有有效预防性阻塞性肺疾病急性加重的方法，目前主要的治疗药物仅有支气管扩张药、糖皮质激素及抗生素等，患者预后往往不良。目前的研究发现， miRNAs在慢性阻塞性肺疾病急性加重过程中扮演着重要角色，有望成为慢性阻塞性肺疾病急性加重的生物标志物。

慢性阻塞性肺疾病急性加重期，患者主要表现为呼吸困难明显加重，痰量多且为脓性， 长期反复加重导致患者呼吸肌代偿减弱，最终导致呼吸衰竭，甚至需呼吸肌辅助通气治疗。 目前骨骼肌耗竭已被用作慢性阻塞性肺病患者死亡率的预测指标。有研究发现，全身炎症因子，如 TNF-α、IL-6、IL-8 等表达增多可能抑制骨骼肌的收缩及蛋白的降解，从而导致骨骼肌衰竭。此外，核蛋白(NCL)也与肌肉功能相关，研究发现，在性阻塞性肺疾病急性加重患者体内，miR-1及 miR-206也能通过对NCL的调控而导致骨骼肌功能障碍[24]。

Wnt 信号通路被认为是介导慢阻肺发展的重要靶点，其缺失可引起肺发育不全和T辅助细胞(Th)所诱导的肺出血。研究显示，miR-15a、miR-16 在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者中过表达，而 miR-15a、 miR-16可抑制 Wnt信号通路的表达，从而影响肺的发育与损害。此外，miR-146在急性期慢阻肺患者中与IL-1β、LTB4呈负相关，而在稳定期慢阻肺中仅与TNF-α呈负相关[25-26]。因此， miR-146 可作为预测稳定期慢阻肺和 性阻塞性肺疾病急性加重的生物标志物。

miR-125b是一种由低氧调节的miRNA,早期研究即表明，miR-125a与系统性红斑狼疮(SLE)炎症趋化因子途径有关。目前研究发现 miR-125b可通过调节气道上皮细胞的凋亡而引起肺组织的损伤，也可以抑制巨噬细胞的经典活化，抵抗炎症反应，同时又可促进巨噬细胞的活化，帮助炎症扩散，进而导致阻塞性肺疾病急性加重。研究证实，miR-125b在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者血清中的表达水平明显高于稳定期慢阻肺患者与健康对照者，而在稳定期慢阻肺患者与健康对照组之间则未见明显差异。为进一步了解其差异，一组关于miR125b在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者治疗前后的比较中发现，miR-125b表达水平在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者治疗后的第 7 天、第 14 天、第 28 天呈逐渐下降趋势，且与稳定期慢阻肺患者相比，慢性阻塞性肺疾病急性加重患者血清 TNF-α、IL-6、IL-1β和 LTB4 水平明显升高[27-28]，由此可知，miR-125b可能是一种促炎因子，可作为一种新的诊断AECOPD的有前景的生物标志物。

结 语

慢阻肺是现代医学面临的一项巨大的挑战，无论从其高发病率或是高致残率角度考虑， 都迫切需要寻找一种新方法、新手段来提供更好的预防与诊疗策略。目前诸多研究表明，多种 miRNA 参与了慢阻肺的炎症反应、气道重塑、肺气肿严重程度及其急性加重过程，故而猜测 miRNAs 或许可作为新一代治疗靶向药物，在慢阻肺预防、临床症状缓解或者逆转疾病进展等方面发挥作用。

依据当前对表观遗传学的研究发现，miRNAs与表观遗传机制之间存在复杂的相互作用。一方面，miRNA的时空表达受到表观遗传机制的严格控制，如启动子区域的DNA甲基化或组蛋白去乙酰化；另一方面，mirRNAs还可通过调节表观遗传机制的单个组分的表达如组蛋白去乙酰化酶或DNA甲基转移酶来影响表观遗传机制，并且两者间复杂的相互作用都参与了人类不同疾病的发生发展。所以，未来的研究应该解决miRNAs和表观遗传机制之间复杂的相互作用，毕竟每一个miRNAs都身处于一个庞大的调节网络之中。