miR-127-5p靶向IRAK4对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子表达的影响

谢丹 文丹宁 罗丹

肺炎链球菌广泛存在于自然界中，感染后可引起肺炎[1]。肺炎链球菌肺炎是呼吸系统主要疾病之一，严重影响患者的生活和健康。肺泡上皮细胞凋亡是肺炎发生发展的重要病理过程[2]。肺泡上皮细胞是覆盖在肺泡上层的细胞，具有屏障保护功能，其在肺组织损伤修复过程中发挥重要作用[3]。近年来研究发现，microRNA(miRNA)在多种疾病过程中发挥重要作用。研究显示，重症肺炎患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中miR-127-5p的表达量明显低于肺呼吸道感染术后患者，miR-127-5p可作为诊断重症肺炎的分子标志物[4]。白细胞介素1受体相关激酶4(Interleukin-1 receptor-related kinase 4，IRAK4)与多种炎症性疾病密切相关，其在肝脏损伤中高表达，是内毒素信号传导通路导致的肝脏损伤的重要因素[5]。但miR-127-5p和IRAK4在肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中的表达及其对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响，且miR-127-5p是否通过靶向调控IRAK4的表达，影响肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子的表达，目前还尚未可知。本研究通过分子生物学技术探究miR-127-5p、IRAK4在肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中的表达及其作用机制。

资料与方法

一、材料

肺泡上皮细胞A549购自中国科学院细胞库，胰蛋白酶购自美国Sigma，胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，Trizol购自美国Ambion公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度试剂盒购自大连TAKARA公司，lipofectamine TM2000转染试剂盒购自美国Santa Cruz公司，miR-127-5p minic和阴性对照序列miR-NC、si-IRAK4、si-NC、pcDNA-IRAK4、pcDNA-NC购自山东维真生物技术有限公司，ECL发光液购自美国R&D公司，IRAK4、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗购自美国CST公司，IgG二抗购自北京博奥森生物技术公司，白介素10(Interleukin 10，IL-10)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)ELISA试剂盒购自上海纪宁生物科技有限公司。

二、实验方法

1 细胞的培养 肺泡上皮细胞A549细胞置于含有10%胎牛血清和双抗(100U/L青霉素、100mg/L链霉素)的RPMI-1640培养基，5%CO2、37℃培养箱传代培养，细胞密度达到80%～90%时，0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代培养。

2 实验分组及处理 肺泡上皮细胞A549分为对照组、感染组，其中感染组细胞密度达到80%～90%时，使用1×108CFU/mL肺炎链球菌培养细胞[6]，对照组细胞正常培养。

3 载体构建及细胞转染 构建miR-NC、miR-127-5p mimic、pcDNA-NC、pcDNA- IRAK4质粒。取对数生长期肺泡上皮细胞A549，调整细胞浓度为4×105个/mL，以每孔2mL接种于6孔板中，5%CO2、37℃培养箱中孵育过夜，细胞密度达到60%作用时，弃去培养基，添加无血清培养基孵育1h；更换无血清培养基，使用lipofectamine TM2000分别将miR-NC、miR-127-5p mimic、si-IRAK4、si-NC转染至A549细胞，获得稳定高表达miR-127-5p的A549细胞株；另外在稳定高表达miR-127-5p 的A549细胞株的基础上转染pcDNA-NC、pcDNA- IRAK4，获得稳定高表达IRAK4的miR-127-5p mimic+pcDNA-IRAK4细胞株。肺炎链球菌刺激感染的细胞在转染后48 h进行感染。

4 qRT-PCR检测mRNA表达水平 收集细胞，提取细胞中总RNA，反转录试剂盒反转录为cDNA进行qRT-PCR，miR-127-5p、IRAK4分别以U6、β-actin为内参基因，反应体系为20 uL：2×SYBR Mix10uL，上下游引物各0.5uL，10×cDNA模板1uL，H20 8uL。反应程序为95℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72℃ 20 s，共40个循环。引物序列：miR-127-5p：F 3′-TTCCCACCTGCGGGGTG-5′，R 5′-TCTAGAGAAATCTTTGAATGCCAAG-3′；U6：F 5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；IRAK4 ：F 3′-GTCATGACCAGCCGAAT CGTG-5′，R 5′-CAGACACTGGTCAGCAGCAGA-3′；GAPDH：F 5′-TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC-3′，R 5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。采用 2-ΔΔct方法计算miR-127-5p、IRAK4的相对表达量，实验重复3次取平均值。

5 western blot法检测蛋白表达情况 收集细胞，加入含有PMSF的RIPA裂解液提取总蛋白，BCA工作液测定蛋白浓度；SDS加热变性蛋白；每孔加入40ug蛋白，SDS-PAGE凝胶跑胶；目的蛋白湿转至PVDF膜；5%BSA室温封闭1h，加入稀释一抗4℃孵育过夜，TBS洗3次/5 min；二抗室温孵育1 h，TBS洗3次/5 min；ECL显色液，AI600凝胶成像仪采集图片，Image ProPlus软件进行灰度分析，GAPDH为内参进行灰度值比较。

6 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 收集处理后细胞，预冷PBS清洗3次，加入500 μL 1×Binding Buffe制备1×106个/mL细胞悬液，然后按顺序加入10 μL PI和5 μL Annexin V-FITC，避光放置5min，流式细胞仪检测凋亡细胞情况。

7 双荧光素酶实验检测miR-127-5p 对IRAK4的影响 构建野生型IRAK4-3’UTR(WT-IRAK4 3’UTR)和突变型IRAK4-3’UTR(MUT-pGL3-IRAK4-3’UTR)质粒，lipofectamine TM2000转染至miR-con、miR-127-5p A549细胞中，转染后48 h检测荧光强度。

8 ELISA检测IL-10、IL-6水平 收集待检测组培养24 h的细胞培养液上清，按照试剂盒说明书，采用ELISA检测IL-10、IL-6水平。

三、统计学方法

结 果

一、肺炎链球菌感染对肺泡上皮细胞中miR-127-5p和IRAK4表达的影响

与对照组比较，肺炎链球菌感染后感染组A549细胞中miR-127-5p表达水平显著降低，IRAK4 mRNA及蛋白水平显著升高。P<0.05(图1，表1)。

图1 IRAK4蛋白表达

表1 肺炎链球菌感染对肺泡上皮细胞中miR-127-5p和IRAK4表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05

二、miR-127-5p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

与对照组比较，肺炎链球菌感染后感染组A549细胞中miR-127-5p表达水平显著降低，凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白水平显著降低，Bax蛋白水平显著升高，炎症因子IL-10水平降低，IL-6水平显著升高(P<0.05)；与感染+miR-NC组比较，过表达miR-127-5p后，A549细胞中miR-127-5p表达水平显著升高，凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白水平显著升高，Bax蛋白水平显著降低，炎症因子IL-10水平升高，IL-6水平显著降低，P<0.05(见图2，表2)。

图2 miR-127-5p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响

表2 miR-127-5p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与感染+miR-NC组比较，#P<0.05

三、抑制IRAK4表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

与对照组比较，肺炎链球菌感染后感染组A549细胞中IRAK4表达水平显著升高，凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白水平显著降低，Bax蛋白水平显著升高，IL-10水平降低，IL-6水平显著升高(P<0.05)；与感染+si-NC组比较，抑制IRAK4表达后，A549细胞中IRAK4水平显著降低，凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白水平显著升高，Bax蛋白水平显著降低，IL-10水平升高，IL-6水平显著降低，P<0.05(见图3，表3)。

图3 IRAK4和凋亡相关蛋白表达

表3 抑制IRAK4表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与感染+si-NC组比较，#P<0.05

四、miR-127-5p靶向调控IRAK4的表达

TargetScan生物信息学数据库检索显示，miR-127-5p与IRAK4 3’UTR存在互补序列(图4A)。双荧光素酶报告实验显示，与miR-NC-WT-IRAK4比较，miR-127-5p-WT-IRAK4组双荧光素酶活性显著降低，miR-NC-MUT-IRAK4与miR-127-5p-MUT-IRAK4组无显著差异，提示miR-127-5p与直接与IRAK43’UTR区域特异性结合(表4)。进一步验证miR-127-5p与IRAK4的关系，Western blot结果显示，过表达miR-127-5p的A549细胞中IRAK4蛋白水平显著下降，抑制miR-127-5p的A549细胞中IRAK4蛋白水平显著升高(图4B，表5)，进一步证实了miR-127-5p可通过与IRAK4特异性结合负向调控IRAK4的表达。

图4 miR-127-5p靶向调控IRAK4的表达

A: IRAK4的3’UTR中含有与miR-127-5p互补的核苷酸序列；B: IRAK4蛋白表达

表4 双荧光素酶报告实验

注：与miR-NC组比较，*P<0.05

五、IRAK4过表达逆转了miR-127-5p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的作用

与miR-NC组比较，过表达miR-127-5p后，A549细胞中IRAK4蛋白表达水平显著降低，凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白水平显著升高，Bax蛋白水平显著降低，IL-10水平升高，IL-6水平显著降低(P<0.05)；与感染+miR-127-5p+pcDNA组比较，感染+miR-127-5p+pcDNA-IRAK4组A549细胞中IRAK4水平显著升高，凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白水平显著降低，Bax蛋白水平显著升高，IL-10水平降低，IL-6水平显著升高，P<0.05(见图5，表6)。

表5 miR-127-5p调控IRAK4蛋白的表达

注：与miR-NC组比较，*P<0.05；与anti-miR-NC组比较，#P<0.05

图5 IRAK4和凋亡相关蛋白表达

讨 论

肺炎是临床常见的呼吸系统疾病，肺炎链球菌是导致肺炎的主要病原菌。肺泡上皮细胞可合成、分泌细胞因子，调节肺泡表面张力，参与肺部炎症反应[7]。肺炎链球菌感染后，肺泡上皮细胞出现结构与功能的变化，细胞凋亡增加，局部生理机能丧失[8]。肺泡上皮细胞的凋亡是导致细胞防御功能丧失、机体抗感染能力下降的重要原因[9]。

研究显示，肺泡上皮细胞A549细胞的凋亡率与肺炎链球菌呈时间依赖性增加[10]。细胞凋亡过程涉及线粒体信号通路、死亡受体信号通路，其中线粒体信号通路中的Bcl-2/Bax在细胞凋亡中发挥重要作用[11]。Bax、Bcl-2均是Bcl-2基因家族成员，Bcl-2为抗凋亡蛋白，Bax在线粒体应激信号通路的细胞凋亡中具有关键作用，其既拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，又促进细胞凋亡[12-13]。细胞中Bax多以单体形式存在于胞浆中，Bax从细胞浆中转移到线粒体膜后与Bcl-2结合形成异二聚体，Bax表达升高可抑制Bcl-2的凋亡抑制作用进而促进细胞凋亡[14]。本研究结果显示，肺炎链球菌感染后，细胞凋亡率增加，Bax水平显著升高、Bcl-2水平下降，提示细胞凋亡在肺炎链球菌肺炎病理过程中发挥重要作用。肺炎链球菌感染肺泡上皮细胞后引起细胞因子合成、分泌的改变，促炎因子和抗炎因子在炎症性疾病中发挥相反作用。研究报道，促炎因子IL-6随着肺炎链球菌刺激时间的延长表达增加，而抗炎因子IL-10水平与刺激时间呈负相关[15]。本研究结果显示，肺炎链球菌感染后A549细胞中IL-10水平显著降低，IL-6水平显著升高，提示肺炎链球菌感染引起炎症反应。

表6 IRAK4过表达逆转了miR-127-5p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的作用

注：与感染+miR-NC组比较，*P<0.05；与感染+miR-127-5p+pcDNA组比较，#P<0.05

miRNA是一类大小约20～25个核苷酸的非编码小分子RNA，其通过与靶基因特异性结合，调控基因的表达，参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程。miR-127-5p在多种炎症损伤性疾病中异常表达，研究表明，miR-127-5p在骨关节炎软骨细胞中的表达显著低于正常软骨细胞，miR-127-5p高表达可促进软骨细胞增殖，抑制炎性反应[16]。与健康大鼠相比，miR-127在2型糖尿病大鼠中表达下调，过表达miR-127，可抑制糖尿病炎性疾病的发展[2,17]。miR-127-5p在肺炎患者中的表达，被证明可作为重症肺炎的分子标志物[4]。本研究结果显示，miR-127-5p在肺炎链球菌感染后A549细胞中表达下调，过表达miR-127-5p后，A549细胞中细胞凋亡率降低、Bax、IL-6显著降低，Bcl-2、IL-10水平显著升高，提示过表达miR-127-5p可抑制肺炎链球菌引起的细胞凋亡与炎性因子的分泌。

IRAK4与多种炎症性疾病密切相关，高糖条件下，心肌细胞中IRAK4蛋白显著上调，沉默IRAK4 可显著抑制高糖诱导的心肌细胞的凋亡，提高细胞的活力，其可能通过调节NF-kB活性及其下游炎症介质的表达发挥作用[5,18]。抑制IRAK4的表达是脂多糖预处理减轻肝脏缺血再灌注损伤的重要机制之一[6,19]。脑缺血性损伤早期大鼠额顶叶皮层组织IRAK-4表达水平迅速上调，早期抑制其功能可发挥有效的脑保护作用[7,20]。本研究结果显示，肺炎链球菌感染后A549细胞中IRAK4水平显著升高，提示其可能参与肺炎疾病过程。抑制IRAK4表达后，A549细胞中细胞凋亡率、IRAK4、IL-6水平显著降低，IL-10水平显著升高，提示抑制IRAK4可抑制肺炎链球菌引起的细胞凋亡与炎性因子分泌失衡。

生物信息学预测显示，miR-127-5p与IRAK4 3’UTR区域存在互补序列，双荧光素酶报告实验显示，miR-127-5p与IRAK4可直接结合；Western blot进一步证实，miR-127-5p可通过与IRAK4直接结合负向调控IRAK4的表达。进一步验证miR-127-5p与IRAK4在肺炎链球菌感染中的作用，在稳定过表达miR-127-5p的感染细胞中转染pcDNA-IRAK4，结果显示，A549细胞中凋亡率、IRAK4、Bax、IL-6水平显著升高，Bcl-2、IL-10水平显著降低，提示过表达IRAK4可逆转miR-139-5高表达对A549细胞的保护作用。

综上所述，本文初步探讨miR-127-5p与IRAK4在肺炎链球菌感染中的作用及机制，可为临床治疗提供理论依据。