纳米陶瓷对堆肥基质高羊茅种子萌发、幼苗生长和生理的影响

李婷婷，赵树兰，多立安

（天津师范大学生命科学学院，天津300387）

堆肥技术基于有氧条件下有机物的生物降解，可有效回收生活垃圾并将其转化为有机肥料.在土壤中添加堆肥可以改善土壤结构，增加保水性，能够为植物生长提供养分并减少植物对化学肥料的依赖[1].然而，如果生活垃圾未实行分类，堆肥中可能会含有大量的重金属，长期施用会将重金属引入土壤中并被植物吸收，最终通过食物链威胁人类健康[2].

草坪绿化是城市现代化的重要标志.目前，我国草坪基质的供应不足是限制草坪建设的因素之一.在草皮生产中，为保证质量，生产草皮的土壤条件必须良好，每完成1 次草皮生产过程，至少要铲去2 cm 以上的熟土，连续3～4 次操作，肥沃的农田将遭到破坏.近年来，将垃圾堆肥用于草坪及其他园林绿地建设的研究受到关注.如邵华伟等[3]研究生活垃圾堆肥对早熟禾生长的影响，发现土壤中配以生活垃圾堆肥可以促进早熟禾的生长；赵树兰等[4]研究表明，用垃圾堆肥作为草坪基质可以提高黑麦草和高羊茅的光合能力，且显著增加植物叶片的叶绿素含量.然而基质中的重金属问题如果得不到根本解决，则会存在污染地下水和影响植物生长的风险.钝化可以将重金属从生物可利用态转化为稳定态，降低重金属的生物利用率，因此被广泛用于重金属污染土壤的修复[5].目前，用于土壤重金属钝化的纳米材料主要包括纳米结构矿物、纳米金属和氧化物、生物质纳米碳和其他纳米碳材料[6].森美思纳米陶瓷材料是一种国内自主研发的单层分子多孔陶瓷功能纳米材料，在纳米陶瓷材料表面引入官能团使其具有较大的比表面积，从而有效去除土壤和水中的重金属离子，可以作为钝化剂改善重金属污染的土壤和水体[7].但是在堆肥基质里添加纳米陶瓷材料可能会对植物生长产生影响.

本研究以生活垃圾堆肥作为高羊茅（Festuca arundinacea）的培养基质，选择纳米陶瓷材料为重金属钝化剂，探究草坪堆肥基质添加纳米陶瓷对高羊茅生长和保护酶活性的影响，为纳米材料安全应用于堆肥基质重金属的钝化和风险评估提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

垃圾堆肥来自天津小淀垃圾堆肥处理厂，去除其中的杂质，风干后过2 mm 筛子.堆肥的理化性质：pH 值为7.62，有机质质量分数为22.1%，全氮为1.35%，有效磷为78 mg/kg，碳氮比为8.37，饱和含水量为 0.76 mL/g，重金属 Cd、Cr、Cu、Pb 和 Zn 的含量分别为 1.97、67.00、239.00、172.00 和 496.00 mg/kg.

测定高羊茅生理指标的试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司.纳米陶瓷材料由格丰环保科技有限公司提供，比表面积为180～900 m2/g，粒径为28 nm.高羊茅种子购自江苏瑞通种业有限公司.

1.2 方法

取生活垃圾堆肥70 g， 将纳米陶瓷材料按质量分数 0（对照）、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和 3.0%分别加入到直径为90 mm 的培养皿中，混合均匀，作为高羊茅培养基质，每个处理4 次重复.每个培养皿播种100 粒大小均一、籽粒饱满的高羊茅种子，为了易于出苗和促进出苗时间的统一度，在播种之前，将种子在水中浸泡一晚，取出晾干，随即播种[8].在培养期间定期浇水，使含水量保持在最大田间持水量的65%.培育温度为15～27 ℃，相对湿度为22%～36%，自然光照.播种后第45 d 收获植物地上部分.

1.3 指标测定

种子萌发：种子从第4 天开始萌发，每天记录萌发的种子数；萌发12d 时测定发芽率（germinationrate，Gr）、发芽势（germination potential，Gp）和发芽指数（germination index，GI）.发芽率 Gr（%）=（发芽种子数/供试种子数）×100；发芽势 Gp（%）＝（萌发起 4 d 内发芽种子数/供试种子数）×100；发芽指数 GI= ∑（Gt/Dt），式中Gt 为在t 日的发芽种子数，Dt 为相应的发芽天数.

生物量：将收获的高羊茅地上部分在108 ℃下杀青20 min，再在80 ℃下烘干至恒重，称重.

叶绿素含量：称取0.1 g 新鲜叶片，切成1～2 mm薄片，浸泡在 10 mL 丙酮和乙醇混合液中（V丙酮∶V乙醇=1 ∶1），避光浸泡24 h 直至叶子完全脱色，浸泡液为测试液.以丙酮为对照，用紫外分光光度计测定663 nm和645 nm 处的OD 值，计算叶绿素a、b 和总叶绿素含量.

抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量：称取0.1 g新鲜叶片，加入1 mL 提取液，并将混合物在冰浴中均化.在4 ℃、8 000 r/min 下离心10 min，将上清液转移至10 mL 离心管中进行测定.SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量的测定严格按照试剂盒说明书进行.

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBisco）活性：称取0.1 g 高羊茅叶片，加入1 mL 提取液，冰浴匀浆，超声破碎.在4 ℃、8 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液，严格按照试剂盒说明书进行酶活性测定.

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行单因素方差分析，采用Duncan 法，在P=0.05 水平进行数据差异统计学意义检验，采用Origin 8.0 作图.

2 结果与分析

2.1 纳米陶瓷对高羊茅种子萌发的影响

播种4 d 后，高羊茅种子开始萌发，在第12 天时趋于稳定.不同的纳米陶瓷添加量下，高羊茅种子的发芽情况如表1 所示.

表1 纳米陶瓷对高羊茅种子萌发的影响Tab.1 Effect of nano-ceramics on seed germination of F.arundinacea

由表1 可以看出，与对照相比，纳米陶瓷添加量为0.5%时，高羊茅种子的发芽率、发芽势和发芽指数略有增加，差异不具有统计学意义（P>0.05）.随着纳米陶瓷添加量的增加，发芽率、发芽势和发芽指数均呈显著下降趋势：发芽率和发芽指数在3.0%处理组中数值最低，与对照相比分别降低了46.77%和63.28%；发芽势在2.5%处理组中最低，与对照相比降低了66.67%.

2.2 纳米陶瓷对高羊茅生物量和叶绿素含量的影响

基质中添加纳米陶瓷后高羊茅地上生物量和叶绿素含量的变化如表2 所示.

表2 纳米陶瓷对高羊茅地上生物量及叶绿素含量的影响Tab.2 Effect of nano-ceramics on biomass and chlorophyll content of F.arundinacea

由表2 可以看出，纳米陶瓷添加量为0.5%时，高羊茅地上生物量有所增加，但与对照之间的差异不具有统计学意义（P>0.05）.随着纳米陶瓷添加量的增加，高羊茅地上生物量呈下降趋势，在3.0%处理组中达到最低，与对照相比降低了64.38%.叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均随着纳米陶瓷添加量的增加呈上升趋势，在3.0%处理组中达到最大值，与对照相比分别增加了27.78%、12.71%和22.64%.

2.3 纳米陶瓷对高羊茅抗氧化酶活性和MDA 含量的影响

基质中添加纳米陶瓷对高羊茅抗氧化酶活性和MDA 含量的影响如图1 所示.

图1 纳米陶瓷对高羊茅SOD、POD、CAT 活性和MDA 含量的影响Fig.1 Effect of nano-ceramics on SOD，POD，CAT activity and MDA content of F.arundinacea

由图1（a）～图1（c）可以看出，纳米陶瓷添加量为0.5%时，高羊茅的抗氧化酶活性与对照相比显著下降.随着纳米陶瓷添加量的增加，SOD、POD 和CAT 均显著增加，在纳米陶瓷添加量为1.5%时抗氧化酶活性达到最大值，分别比对照高出12.20%、19.43%和18.07%.随着纳米陶瓷添加量的进一步增加，抗氧化酶的活性又呈下降趋势.

由图1（d）可以看出，堆肥中纳米陶瓷的添加量为0.5%时，MDA 含量降至最低，与对照相比降低了12.67%，而后MDA 含量随着纳米陶瓷添加量的增加而增加，在3.0%处理组中达到最大，与对照相比增加了116.87%.

2.4 纳米陶瓷对高羊茅RuBisco活性的影响

基质中添加纳米陶瓷对高羊茅RuBisco 活性的影响如图2 所示.

图2 纳米陶瓷对高羊茅RuBisco 活性的影响Fig.2 Effect of nano-ceramics on RuBisco activity of F.arundinacea

由图2 可以看出，纳米陶瓷添加量为0.5%时，与对照相比高羊茅的RuBisco 活性几乎没有变化.随着添加量的进一步增加，RuBisco 活性显著下降，在3.0%处理组中达到最小值，与对照相比降低了38.8%，差异具有统计学意义（P<0.05）.

3 讨论

种子萌发是植物生命周期的第一阶段，直接决定着植物后期的生长.本研究考察堆肥基质添加纳米陶瓷对高羊茅种子萌发和生长的影响，结果发现，0.5%的纳米陶瓷处理对种子萌发和地上生物量有轻微的促进作用，超过0.5%的处理则显著抑制了种子萌发和地上生物量的积累.Khan 等[9]的研究表明，基质中的纳米颗粒会诱导氧化胁迫，对植物产生细胞和遗传毒性，从而影响植物的生长发育，主要表现为抑制种子萌发和幼苗生长.Lin 等[10]的研究也表明，高浓度的纳米Zn 和ZnO 抑制了黑麦草和玉米的种子萌发，纳米颗粒对植物生长发育的影响存在着浓度相关性，高浓度下会存在明显的抑制效应.

叶绿素作为植物光合作用的主要色素，其含量高低可直接反映植物光合作用的强弱.本研究结果表明，随着堆肥基质中纳米陶瓷添加量的增加，高羊茅的叶绿素含量逐渐增加.王国栋等[11]的研究发现，纳米碳能有效提高草莓叶片的叶绿素含量，这是由于纳米碳有效促进了叶绿体内淀粉粒的合成和运输，提高了植物的光合利用效率，且纳米碳的表面效应和小尺寸效应能促进植物对氮素的吸收.彭鸣等[12]的研究表明，植物体内的叶绿体结构能被重金属离子破坏.本研究中的堆肥重金属也构成了逆境胁迫，而纳米陶瓷材料会在一定程度上吸附堆肥中的重金属，降低高羊茅的吸收，从而减少重金属对叶绿体的破坏，使叶绿素含量增加.

正常情况下，植物体内的活性氧处于平衡状态.当受到逆境胁迫时，植物体内的活性氧会大量积累，导致膜脂过氧化，MDA 含量可以表示膜脂过氧化的程度.在本研究中，当纳米陶瓷添加量为0.5%时，高羊茅组织中的SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量均低于对照组的数值，可能是由于纳米陶瓷材料的钝化作用使重金属对高羊茅的毒性受到抑制.这与金睿等[13]的研究结果相似，他们用生物炭复配调理剂处理被重金属污染的土壤后，小白菜植株的SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量下降.当纳米陶瓷含量大于0.5%时，抗氧化酶的活性随着纳米陶瓷添加量的增加呈现先增加后降低的趋势，MDA 含量一直呈增加趋势.这是因为植物中的抗氧化酶系统起着活性氧清除剂的作用，当活性氧在植物组织中被诱导时，抗氧化酶的活性逐渐增加[14]，当胁迫继续增加时，抗氧化酶系统对活性氧的清除能力受到抑制，过量的活性氧物质会直接攻击蛋白质、脂类和DNA 等生物大分子，引起脂质过氧化，从而导致机体损伤[15].这些结果说明纳米陶瓷的添加量超过0.5%时，随着添加量的增加，纳米陶瓷对高羊茅组织的损伤逐渐增大.Li 等[16]用纳米颗粒处理水稻和拟南芥时，也发现水稻和拟南芥的活性氧增加并引发细胞死亡.Nel[17]认为，纳米颗粒产生毒性的首要原因就是活性氧的过度积累.

RuBisCO 是一种可溶性大分子，是植物光合作用过程中固定CO2的关键酶，同时也参与植物的光呼吸代谢途径，消耗植物光合作用合成的有机物[18].本研究发现，随着纳米陶瓷添加量的增加，高羊茅的MDA 含量增加，RuBisCO 酶活性降低，这可能是因为过量的纳米陶瓷会诱导活性氧积累，从而导致RuBisCO 蛋白的加速降解.高等植物的RuBisCO 活性与植物的生物量密切相关，本研究发现，高羊茅叶片中RuBisco 的活性随着纳米陶瓷添加量的增加而下降，这与生物量的变化趋势一致.

4 结论

（1）堆肥基质中添加0.5%的纳米陶瓷对高羊茅种子萌发和生物量有轻微促进作用，随着纳米陶瓷添加量继续增加，种子萌发受到明显抑制，生物量也显著下降，3.0%处理组中数值达到最小.高羊茅幼苗的叶绿素含量则随着纳米陶瓷添加量的增加而增大.

（2）纳米陶瓷添加量为0.5%时，幼苗的抗氧化酶活性显著低于对照，随着添加量的增加，抗氧化酶活性先升后降，添加量为1.5%时酶活性达到最大，添加量为3.0%时酶活性受到显著抑制.

（3）纳米陶瓷添加量为0.5%时，幼苗的MDA 含量略有下降，RuBisCO 的活性保持不变.随着添加量的增加，MDA 含量持续增加，RuBisco 活性持续下降.添加量达到1.5%时，纳米陶瓷引起膜脂过氧化，MDA含量显著增加，RuBisco 活性显著下降.因此，以堆肥为基质培养高羊茅时，纳米陶瓷的添加量应小于0.5%.