血清miR-27与老年2型糖尿病下肢血管病变及25(OH)D3水平的关系

陈云霞，苏俊平，刘海勇，陈雪，马莹

下肢血管病变(lower limb peripheral arterial disease，LLPAD)是外周动脉疾病的主要表现，2型糖尿病是LLPAD的既定危险因素，2型糖尿病患者LLPAD预后差，进展快，血管系统病变范围更广，更易形成狭窄和闭塞[1]。2型糖尿病的末梢神经病变导致患者疼痛感丧失和间歇性跛行的频率降低，即使并发LLPAD，也难被发现，直到病情加重进展，表现为溃疡或坏疽等LLPAD末期症状，最终被迫截肢[2]。微小RNA(miRNA)是一组微小的非编码单链RNA，通过翻译后mRNA切割或降解来调节基因表达[3]。miR-27在矿物质代谢的调节(磷酸钙稳态)中起重要作用，促进血清Ca2+水平升高。研究表明，miR-27通过其对血管钙化和内皮功能障碍的影响诱导动脉粥样硬化的发生和发展。最近，临床研究提供了支持循环miR-27水平升高与动脉粥样硬化性心血管疾病之间关系的证据[4-5]。多项研究表明，血清miR-27水平不仅与亚临床动脉粥样硬化有关，而且与冠状动脉疾病有关，表明miR-27参与动脉粥样硬化的发生和发展[6]。而关于miR-27与老年2型糖尿病下肢血管病变的研究较少。25-羟维生素D3[25(OH)D3]与骨代谢密切相关。现分析血清miR-27与老年2型糖尿病下肢血管病变及25(OH)D3水平的关系，为老年2型糖尿病下肢血管病变的治疗提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年10月—2019年5月河北省沧州市人民医院内分泌科确诊老年2型糖尿病患者86例为T2DM组，符合中国2型糖尿病防治指南(2013年版)的诊断标准[7]，男45例，女41例，年龄60～87(74.85±13.85)岁；病程4～14(9.65±5.41)年；吸烟40例，饮酒35例 。根据是否发生下肢血管病变，分为下肢血管病变(LLPAD)亚组44例和非下肢血管病变(Non-LLPAD) 亚组42例。选择同期医院门诊健康体检者76例为对照组，对照组无糖尿病或高血压家族史，血压、血脂正常。2组性别、年龄、基础病、合并症、BMI、吸烟、饮酒情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经医院伦理委员会审批通过,所有受试者均知情同意并签署知情同意书。

表1 对照组、T2DM组临床资料比较

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①年龄≥60岁，病程均>6个月；②稳定的血糖降低方案至少3个月；③过去6个月内无创伤或手术；④无严重的心脑肝肾疾病；⑤代谢稳定至少6个月；⑥在过去1个月内使用血管超声，下肢血管造影或磁共振成像诊断下肢外周血管疾病，踝臂指数(ankle/brachial index，ABI)<0.9。(2)排除标准：①1型糖尿病，妊娠糖尿病或其他特定类型的糖尿病；②肝肾功能不全；③甲状腺功能减退症，急性感染，恶性肿瘤或精神疾病。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 miR-27表达水平检测：抽取研究对象清晨空腹肘静脉血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 离心5 min，分离血清。采用Trizol Reagent试剂(美国Invitrogen公司)从血清中提取总RNA；BioPhotometer Plus核酸蛋白定量检测仪(美国赛默飞世尔公司)分析总RNA浓度；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(宝日医生物技术北京有限公司)进行实时定量PCR。PCR引物的序列如下，miR-27正向引物5'-CTTGATCGCAAGGGTTGAGTCT-3'，反向引物5'-TTGTGTACGTGAGGTGCAGACTGATGC-3'。U6正向引物5'-CCTGTGTGACTGGCTTGTGTGATGC-3'；反向引物5'-TGAGTGCTGACACGAACCTGTGAGT -3'。反应条件为预变性95℃ 30 s、变性 95℃ 5 s、60℃ 44 s，40个循环，61℃时采集荧光，用FX-96实时荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)检测其表达量进行结果分析，以U6作为内参，采用 2-△△Ct法计算miR-27相对表达水平。

1.3.2 血清25(OH)D3测定：抽取研究对象清晨空腹肘静脉血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 离心5 min，分离血清。采用25(OH)D3试剂盒(德国罗氏诊断有限公司)于美国贝克曼AU-580全自动生化分析仪测定血清25(OH)D3。

1.3.3 血生化指标检测：抽取研究对象清晨空腹肘静脉血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 离心5 min，分离血清，以美国贝克曼AU-580全自动生化分析仪测定空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)；美国伯乐680酶标仪测定高敏C反应蛋白(hs-CRP)；Coatron1800全自动凝血分析仪(德国美创公司)测定纤维蛋白原(Fib)。

1.3.4 LLPAD判定：以德国西门子 Acuson SequoiaC512 型彩色多普勒超声诊断仪检测患者足背动脉、胫后动脉、胫前动脉、腘动脉、股动脉内径、斑块大小及狭窄度；动脉内膜增厚(≥1 mm)，单发、多发、弥漫性斑块及狭窄(>30%)均为LLPAD。

2 结 果

2.1 各组相关指标比较 与对照组比较，T2DM组miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平升高(P<0.01)，25(OH)D3、HDL-C水平降低(P<0.01)；与Non-LLPAD亚组比较，LLPAD亚组miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平升高(P<0.01)，25(OH)D3、HDL-C水平降低(P<0.01)，见表2。

2.2 miR-27 mRNA与各指标的相关性分析 miR-27 mRNA与25(OH)D3、HDL-C呈负相关(P<0.05)，与TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG呈正相关(P<0.05)，见表3。

表2 各组相关指标比较

表3 miR-27 mRNA与各指标的相关性分析

2.3 老年2型糖尿病合并下肢血管病变发生的多因素Logistic回归分析 高水平的miR-27 mRNA、TC及低水平的25(OH)D3均为老年2型糖尿病合并下肢血管病变发生的危险因素(OR=2.437、4.268、13.625，P<0.05)，见表4。

2.4 老年2型糖尿病合并下肢血管病变影响因素ROC曲线分析 AUC比较，TC>miR-27 mRNA>25(OH)D3，miR-27 mRNA、25(OH)D3诊断老年2型糖尿病下肢血管病变的敏感度、特异度相近(P>0.05)，均小于TC(P<0.05)；TC、miR-27 mRNA、25(OH)D3的cut-off值为5.432、2.936、24.413 mmol/L；约登指数为0.498、0.364、0.369，见表5、图1。

3 讨 论

糖尿病是严重威胁人类健康的疾病之一。下肢血管疾病是常见的糖尿病严重并发症之一，且发病率逐年上升。糖尿病合并下肢血管疾病的主要病理变化是动脉粥样硬化。据报道，增加的活性氧产物和减少的抗氧化剂在动脉粥样硬化形成中起重要作用。例如，血清超氧化物歧化酶(SOD)和高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平是2型糖尿病伴下肢血管疾病发病的关键。作为抗氧化剂，SOD主要存在于细胞代谢中，通过有毒自由基歧化为无活性的过氧化氢和氧分子在细胞中发挥保护作用[8]。血糖升高可以提高糖基化蛋白的水平。血糖和糖基化蛋白的自身氧化会增加糖尿病患者的自由基水平，抑制抗氧化能力。糖尿病诱导的氧化应激导致内皮细胞损伤。SOD在全身血管疾病中起重要作用。研究表明，miR-27高表达能促进hs-CRP表达，抑制SOD水平。本研究中，T2DM组miR-27 mRNA水平高于对照组；LLPAD亚组miR-27 mRNA水平高于Non-LLPAD亚组，证实了上述结论。

许多证据表明，25(OH)D3在高血糖、胰岛素抵抗(IR)和T2DM的发展中也有作用，并且有越来越多的研究已经发现其可以降低全身性炎性反应、免疫反应和脂肪酶的代谢，从而降低患心血管疾病的风险。第三次全国健康和营养检查调查(NHANES-Ⅲ)发现，与正常浓度25(OH)D3的居民相比，低浓度25(OH)D3的居民外周动脉疾病的发生率更高。本研究中，与对照组比较，T2DM组25(OH)D3平降低；与Non-LLPAD亚组比较，LLPAD亚组25(OH)D3水平降低，这与上述讨论一致。25(OH)D3是保护糖尿病患者免于下肢血管疾病发病的一个因素。25(OH)D3可能通过以下机制参与糖尿病下肢血管病变:维生素D可以通过调节胰腺组织中的维生素D受体(VDR)和维生素D依赖性钙结合蛋白(DBP)来促进胰腺细胞分泌胰岛素。它也可通过调节炎性细胞因子和抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达来降低周围组织的IR。此外，它还可以通过刺激PPARδ和胰岛素受体的基因表达来影响胰岛素敏感性。骨化三醇可以调节肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS)，抑制肾素的表达，调节合成和分泌。维生素D可以上调延迟血管钙化相关蛋白的表达，包括血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶9。

表4 老年2型糖尿病合并下肢血管病变发生的多因素Logistic回归分析

表5 老年2型糖尿病合并下肢血管病变影响因素ROC曲线分析

miRNA是长度约为23 nt的内源性小非编码RNA。血管疾病患者在疾病早期具有某些循环miRNA水平恒定模式。最近的一项研究表明，血管生物学中的不同miRNA可直接或间接地参与血管重塑中基础基因的转录后调控，因此，特定的miRNA可以作为潜在的生物标志物。研究表明，基于miRNA的方法可以抑制增殖性血管平滑肌细胞，可以预防再狭窄，同时选择性地促进再内皮化和保留内皮细胞功能[9-10]。抑制miR-27表达有助于抑制再狭窄和血栓形成，从而保留内皮功能。miR-27位于17号染色体上，是miRNA家族的一个亚型，具有自己的启动子区。miR-27的过度表达被证明涉及多种病理状态，包括癌症和心血管疾病，并且它可以通过调节特定细胞来影响动脉粥样硬化的发展[11-12]。miR-27的反义敲低，可以防止颈内动脉球囊损伤后新内膜损伤的形成。miR-27可以通过促进血管生成来加剧动脉钙化和动脉粥样硬化的发生，平滑肌细胞增殖，并通过免疫细胞的VDR介导在免疫调节中发挥作用。miR-27过表达会导致血清甲状旁腺激素(PTH)水平升高。过高的PTH水平可能至少通过增加心脏收缩力和心肌钙化而部分促进心血管疾病。 miR-27可通过促进炎性细胞因子(如IL-6、TNF-α和CRP)的分泌来加剧动脉壁的慢性炎性反应。

研究表明[13-15]，在外周血管疾病的发病过程中IL-1、PDGF、TNF-α等炎性因子的分泌及细胞外基质(ECM)的沉淀均与25(OH)D3表达呈负相关，同时低度表达的25(OH)D3可通过增加细胞周期蛋白依赖性激酶活性，促进细胞增殖，进而使血管内壁增粗狭窄[16-17]。本结果显示，miR-27 mRNA与25(OH)D3呈负相关，这与上述结论符合。

本结果发现，高水平miR-27 mRNA为老年2型糖尿病合并下肢血管病变发生的危险因素；miR-27 mRNA、25(OH)D3两者的AUC相近，均小于TC；miR-27 mRNA、25(OH)D3诊断老年2型糖尿病下肢血管病变的敏感度、特异度相近，均小于TC，说明miR-27、25(OH)D3诊断老年2型糖尿病下肢血管病变具有较高的敏感度、特异度，可作为判定老年2型糖尿病下肢血管病变的生物学标志物。

综上所述，老年2型糖尿病下肢血管病变患者血清miR-27水平升高，其与25(OH)D3呈显著负相关；miR-27诊断2型糖尿病下肢血管病变具有较高的敏感度、特异度，可作为判定2型糖尿病下肢血管病变的生物学标志物，值得临床推广。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

陈云霞：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；苏俊平：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；刘海勇：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；陈雪：进行统计学分析；马莹：课题设计，论文撰写