冠心病患者PCSK9基因V312F位点多态性与斑块性质、脂代谢及细胞因子的相关性

刘春燕,刘小燕,李平,陈国才,耿召华

冠心病是临床上最常见的心血管疾病之一，近年来随着高脂血症、高血压、糖尿病、肥胖症等代谢性疾病的增多，冠心病的发生率也呈逐年升高的趋势，并对患者的生活质量、生命安全均造成威胁[1]。在冠心病的病情发展变化过程中，冠状动脉斑块的形成及性质的改变与脂代谢紊乱、炎性反应异常激活等环节密切相关，但具体的调控机制仍未十分明确。人枯草溶菌素转化酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是由肝细胞表达并分泌的一类前蛋白转化酶，能够降解低密度脂蛋白胆固醇受体(LDLR)，影响LDLR所介导的LDL-C代谢并使LDL-C在体内蓄积，蓄积的LDL-C在冠状动脉内膜沉积、逐步形成粥样斑块[2-3]。PCSK9基因在多位点存在多态性，多态性的产生会使编码产物降解LDLR的活性发生改变，进而影响LDL-C的代谢并参与动脉粥样硬化的进程。 笔者分析了冠心病患者PCSK9基因V312F位点多态性与斑块性质、脂代谢及细胞因子的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月—2018年6月陆军军医大学附属新桥医院心内科诊断冠心病患者120例作为冠心病组，男69例，女51例，年龄42～62(51.39±7.65)岁；合并高血压46例，糖尿病37例，高脂血症61例；有冠心病家族史23例。另纳入同期于医院体检的健康者100例作为健康对照组，男58例，女41例，年龄39～60(49.93±7.12)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)入组标准：①均有发作性胸痛症状、经冠状动脉CTA确诊为冠心病；②首次诊断为冠心病。(2)排除标准：①合并先天性心脏病、冠状动脉血管畸形；②既往有脑梗死、心肌梗死病史的患者；③合并自身免疫性疾病的患者；④正在服用他汀类药物的患者。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 基因多态性检测： 2组受试者均于晨起空腹时采集肘静脉血2 ml并以EDTA抗凝，按照北京天根公司的血液基因组DNA提取试剂盒进行操作，设计PCSK9基因V312F位点的引物(上游5’-AAAGGGGAGCAGGTCTCCC-3’、下游5’-GCCCGCCCTCCCTCCGCCCTCCG-3’)，配置PCR反应体系50 μl后,按照95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s的程序反应35个循环，收集PCR产物后用ABI(型号：3100Avant)全自动DNA测序仪测定基因序列，根据测序结果判断V312F位点的多态性。

1.3.2 冠状动脉斑块测定： 采用64排双源CT仪进行冠脉CTA检查，扫描范围为主动脉弓肺动脉节段起始至膈肌下1 cm为止；将感兴趣区设置在升主动脉，当CT值达到100 HU时触发扫描，扫描参数为电压120 kV、电流280 mA、层厚0.75 mm、机架旋转时间0.28 s、球管旋转时间0.33 s/r。将图像信息录入影像工作站后测定粥样斑块的CT值(CT值<60 HU为软斑块，60～129 HU为纤维斑块，≥130 HU为钙化斑块)。

1.3.3 血脂检测：2组患者均取空腹静脉血，离心取血清，采用全自动生化分析仪检测低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)的含量。

1.3.4 细胞因子检测： 2组患者均取空腹静脉血，离心取血清，采用酶联免疫吸附法测定趋化素(chemerin)、脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质细胞衍生因子 1α(SDF-1α)的含量。

2 结 果

2.1 2组PCSK9基因V312F位点多态性比较 冠心病组患者PCSK9基因V312F位点TT+TG基因型的比例明显高于健康对照组，GG基因型的比例明显低于健康对照组(P<0.01)；T等位基因的比例明显高于健康对照组，G等位基因的比例明显低于健康对照组(P<0.01)，见表1。

2.2 不同斑块性质患者PCSK9基因V312F位点多态性比较 不同斑块性质患者PCSK9基因V312F位点TT+TG基因型、GG基因型及PCSK9基因V312F位点T等位基因、G等位基因比例比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 不同PCSK9基因V312F位点多态性患者血脂比较 冠心病组中TT+TG基因型患者的血清LDL-C、sdLDL-C、chemerin含量明显高于GG基因型患者，HDL-C、vaspin含量明显低于GG基因型患者，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3。

2.4 不同PCSK9基因V312F位点多态性患者细胞因子比较 冠心病组中TT+TG基因型患者血清M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α含量均高于GG基因型患者，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

3 讨 论

LDL-C是冠状动脉粥样斑块的重要成分，体内脂代谢紊乱及炎性反应过度激活均会促进LDL-C在动脉内膜沉积并形成粥样斑块。PCSK9是体内调节LDL-C代谢过程的蛋白酶，该蛋白酶通过水解LDLR来阻碍LDL-C代谢，造成LDL-C蓄积，冠心病患者的血清PCSK9含量明显升高，但引起PCSK9含量升高的机制尚未完全明确。基因多态性是近年来受到越来越多关注的分子表达调控机制，PCSK9基因被证实在V312F、D320N、E670G等多个位点存在多态性，多态性位点等位基因的突变会造成基因表达发生改变及PCSK9分泌的变化[4-6]。V312F位点的突变类型为等位基因G向T的突变，突变后形成杂合基因型TG及纯合基因型TT。为了明确PCSK9基因V312F位点多态性与冠心病发病的关系，本研究首先分析了冠心病患者PCSK9基因V312F位点的基因型及等位基因，结果显示，冠心病组患者PCSK9基因V312F位点TT+TG基因型的比例、T等位基因的比例明显高于健康对照组，GG基因型的比例、G等位基因的比例明显低于健康对照组，提示冠心病患者存在PCSK9基因V312F位点G向T的突变，该多态性与冠心病的发生密切相关。

在动脉粥样斑块形成的过程中，LDL-C在动脉内膜沉积，随着炎性反应的激活，巨噬细胞在动脉内膜大量浸润、吞噬LDL-C并形成泡沫细胞。LDL-C及泡沫细胞不断聚集、逐步成为粥样斑块[7-8]。冠心病患者体内冠状动脉粥样斑块的性质呈动态变化，在斑块形成的初期阶段、斑块性质稳定，患者的病情也相对稳定；随着斑块体积增大、斑块内LDL-C增多及斑块纤维帽在蛋白酶的作用下发生水解，斑块的稳定性逐步下降，若发生斑块破裂则会诱发血栓形成、出现心肌梗死。PCSK9直接影响LDL-C的代谢，在明确PCSK9基因V312F位点多态性与冠心病发病的关系后，本研究进一步分析了PCSK9基因V312F位点多态性与冠心病患者斑块性质的关系，结果发现，不同斑块性质患者PCSK9基因V312F位点TT+TG基因型、GG基因型的比例及T等位基因、G等位基因的比例有显著差异，斑块性质越不稳定，TT+TG基因型的比例及T等位基因的比例越高。这一结果提示冠心病患者体内PCSK9基因V312F位点G向T的突变会影响斑块性质、使斑块的稳定性下降。

表1 2组PCSK9基因V312F位点多态性的比较

表2 冠心病组中不同斑块性质患者PCSK9基因V312F位点多态性的比较

表3 冠心病组中不同PCSK9基因V312F位点多态性患者血脂指标的比较

表4 冠心病组中不同PCSK9基因V312F位点多态性患者血清细胞因子的比较

PCSK9在体内主要参与LDL-C的代谢，LDL-C代谢紊乱会进一步影响其他脂质成分的代谢。LDL-C升高被认为是心脑血管疾病的独立危险因素，而HDL-C则被认为是心脑血管疾病的保护因素，其功能是促进胆固醇由外周组织向肝脏转运并通过肝脏代谢胆固醇[9-10]。脂代谢紊乱除了表现为LDL-C和HDL-C的变化外，多种脂肪因子的分泌也发生变化。vaspin和chemerin是2种功能不同的脂肪细胞因子，前者能够增加胰岛素敏感性，具有心血管保护作用，后者能够拮抗胰岛素的生物学活性、具有促炎作用[11-12]。冠心病患者血清中LDL-C及chemerin的含量明显升高，而HDL-C及vaspin的含量明显下降。本研究进一步分析了不同PCSK9基因V312F位点多态性冠心病患者脂代谢指标的变化，结果发现，TT+TG基因型患者的血清LDL-C、sdLDL-C、chemerin含量明显高于GG基因型患者，HDL-C、vaspin含量明显低于GG基因型患者。这一结果提示冠心病患者体内PCSK9基因V312F位点G向T的突变会影响脂代谢过程。

动脉粥样斑块的形成涉及脂代谢紊乱及炎性反应的过度激活，炎性反应激活过程中巨噬细胞在动脉内膜大量浸润，吞噬LDL-C后成为泡沫细胞并形成粥样斑块。炎性细胞因子的瀑布式分泌是炎性反应激活的重要特征，M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α是已知的炎性细胞因子，在冠心病患者血清中的含量明显升高[13]。M-CSF和TNF-α具有促炎作用，能够使多种炎性细胞发生活化[14]；IL-6、SDF-1具有趋化活性，能够促进多种炎性细胞的迁移并向粥样斑块浸润[15-16]。本研究通过分析不同PCSK9基因V312F位点多态性冠心病患者细胞因子的变化发现，TT+TG基因型患者的血清M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α含量明显高于GG基因型患者。这一结果提示冠心病患者体内PCSK9基因V312F位点G向T的突变会促进炎性细胞因子的分泌，增强患者体内的炎性反应。

综上所述，冠心病患者PCSK9基因V312F位点存在明显多态性，具体表现为等位基因G向T的突变；该多态性能够降低斑块稳定性，影响冠心病患者体内的脂代谢及细胞因子分泌。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘春燕：负责研究设计、开展和论文撰写；刘小燕、李平：负责临床信息收集；陈国才：负责数据统计分析；耿召华：论文撰写、修改