对叶豆浸膏对特异性皮炎小鼠的影响

付莉慧，杨 敏，杨兴鑫，俞 捷，贺 森，黄 丰，赵荣华，顾 雯

（云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500）

特异性皮炎（atopic dermatitis，AD）是以剧烈瘙痒为主要临床症状的慢性炎症性皮肤病，各年龄段均可发病，以儿童最常见，且近年来其发病率呈不断上升趋势，严重影响患者的生活品质［1］。最新研究显示AD 儿童具有罹患焦虑、抑郁、注意力缺陷多动障碍等精神性疾病的倾向，因此，AD 已成为世界范围内人民健康，特别是儿童健康的重大危害［2］。特异性皮炎的治疗目前大多采用口服抗组胺药和外用激素类药膏，但是长期使用这些药物存在着许多不利因素［3］。对叶豆Cassia alataL.是豆科决明属植物，又名有翅决明、非洲木通，其味辛，性温，入心、脾二经，多外用鲜品，主治神经性皮炎、牛皮癣、湿疹、皮肤瘙痒、疮疖疼痛，是傣族用于治疗皮肤病的常用药［4］。本研究通过检测对叶豆浸膏对特异性皮炎模型小鼠的药效作用，并探讨其可能作用机制，为拓宽相关应用提供理论基础。

1 材料

1.1 动物 普通级6 周龄雌性BALB／c 小鼠54 只，体质量（20±2）g，购于北京华泵康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2014-0004。

1.2 药物 对叶豆浸膏由云南中医学院炮制实验中心提供。取对叶豆全叶加10 倍量90%乙醇回流提取1.5 h，滤过，滤液浓缩至稠膏；药渣以8 倍量的水煎煮1 h，滤过，滤液与上述稠膏合并，减压浓缩至相对密度为1.41～1.45，储存备用。1% 对叶豆浸膏浓度由1 g 对叶豆浸膏加入99 mL 70%乙醇配制而成，10%对叶豆浸膏由10 g对叶豆浸膏加入90 mL 70%乙醇配制而成。

1.3 试剂 复方醋酸地塞米松乳膏（湖北科田药业有限公司，批号160805）；2，4-二硝基氟苯（成都西亚化工股份有限公司，批号J01010）；硫化钠（西陇化工股份有限公司，批号151204）；乙醇（广东光华科技股份有限公司，批号20160927）；IL-4、IL-6、IL-13、IL-16、IL-33、免疫球蛋白E（Ig-E）、TNF-α、IFN-γ ELISA 检测试剂盒（杭州联科生物有限公司，批号分别为 220470431、220670535、221370512、221660641、223370513、227161244、228270625、228070225）。

1.4 仪器 SpectraMax Plus384 酶标仪［美谷分子仪器（上海）有限公司］；HR／T16 M 高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。

2 方法

2.1 动物造模、分组及给药 动物经适应性饲养1 周后用于实验，在特异性皮炎模型造模方面对已有方法［5］进行了一定的改进。将BALB／c 小鼠随机分为正常组、模型组、阴性对照组（70%乙醇）、对叶豆低剂量组（1%）、对叶豆高剂量组（10%）、阳性对照组（复方醋酸地塞米松乳膏），每组9 只。实验前1 d，所有小鼠用8%硫化钠溶液进行背部脱毛（2.5 cm×2.5 cm），暴露皮肤；实验第1、2 天对除正常组以外的小鼠进行造模，即在小鼠背部已脱毛的皮肤上涂抹丙酮-橄榄油混合溶液（3∶1）配置的0.5%2，4-二硝基氟苯溶液，第3～6 天不作任何处理；第7 天开始隔天涂抹1 次0.5% 2，4-二硝基氟苯溶液，70 μL／次，共10 次，21 d 后造模完成。正常组背部已脱毛的皮肤仅涂抹丙酮橄榄油混合溶液，涂抹时间和剂量与造模组一致。造模结束后阳性对照组涂抹复方醋酸地塞米松乳膏，对叶豆低、高剂量组涂抹相应剂量浸膏，正常组和模型组涂抹丙酮-橄榄油混合溶液，阴性对照组（用来排除70%乙醇对实验结果的影响）涂抹70%乙醇，外涂药物1 次／d，给药14 d。

2.2 小鼠局部皮肤组织评价 治疗第14 天，观察各组小鼠皮炎情况并拍照记录。处死小鼠后，用直径6 mm 打孔器在相同部位取下背部脱毛处的皮肤（不含皮下脂肪）用千分卡尺单盲法测定皮肤厚度，用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片、HE 染色后10 倍显微镜下观察组织病理改变，单盲法分别计算10 个高倍视野真皮炎性细胞数，取其平均值。

2.3 小鼠血清细胞因子水平检测 治疗第14 天摘除小鼠眼球取血，室温下静置30 min，在4 ℃下3 500 r／min 离心15 min，获取血清。使用ELISA 试剂盒，按照说明书操作，检测血清IL-4、IL-6、IL-13、IL-16、IL-33、TNF-α、IFNγ、IgE 水平。

2.4 统计学分析 采用SPSS 16.0 统计软件进行分析，实验数据以（±s）表示，采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对叶豆浸膏对AD 模型小鼠皮肤组织的影响

3.1.1 小鼠背部皮损情况 正常组小鼠皮肤正常，组织结构基本正常；模型组小鼠皮肤可见红斑、丘疹、结痂、糜烂样等皮肤损伤改变；阳性对照组小鼠背部皮肤光滑，可见少量的结痂；对叶豆低剂量组小鼠背部有红斑；对叶豆高剂量组小鼠背部皮肤光滑，皮肤无明显糜烂；阴性对照组小鼠皮肤有少许红斑糜烂，不光滑。见图1。

图1 小鼠背部皮损情况

3.1.2 小鼠背部皮损组织病理 正常组表皮真皮结构正常，真皮层未见血管扩张及炎症细胞；模型组角化过度，棘层肥厚明显伴灶性海绵水肿，真皮血管扩张充血较多单核炎性细胞浸润，毛囊结构减少；阳性对照组表皮各层较清晰，真皮血管扩张，炎性细胞较模型组明显减轻，毛囊结构明显增多；对叶豆低、高剂量组明显缓解了炎性细胞，但是棘层还是较厚，毛囊结构明显减少；阴性对照组表皮增厚、细胞间水肿、表皮和真皮内有单核炎性细胞浸润，且较阳性对照组及对叶豆低、高剂量组炎性浸润更严重。见图2。

图2 小鼠背部皮肤HE 染色病理形态观察（×10）

3.1.3 小鼠皮肤厚度和炎性细胞数的变化 与正常组比较，模型组皮肤真皮浸润炎性细胞增多、背部皮肤增厚（P＜0.01）；与模型组比较，对叶豆低、高剂量组均能降低背部皮肤真皮浸润炎性细胞数（P＜0.01），说明对叶豆浸膏有一定抗炎、修复皮肤的作用。见表1。

3.2 对叶豆浸膏对小鼠血清炎症因子水平的影响 与对照组比较，模型组血清IL-16、IL-33、TNF-α、IgE、IL-4、IL-13、IL-6 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，对叶豆高剂量组IL-33、TNF-α、IgE、IL-4、IL-13、IL-6 水平降低（P＜0.01），低剂量组仅IL-13、IL-6 水平降低（P＜0.01）。见表2。

表1 各组皮肤厚度及真皮炎性细胞数比较（±s，n＝9）

表1 各组皮肤厚度及真皮炎性细胞数比较（±s，n＝9）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 讨论

AD 是一个由Th1／Th2 免疫反应引发的双相性炎性皮肤病［6］，Th1／Th2 细胞因子之间存在拮抗关系，IFN-γ 主要是Th1 分泌的细胞因子，IL-4 及IL-13 主要是Th2 分泌的细胞因子，Th1／Th2 失衡可以导致过敏性疾病，Th1／Th2 平衡状态对于保持机体正常的免疫有重要意义［7］。且目前已知胸腺基质淋巴细胞生成素、IL-25、IL-33，特别是IL-33 是激活并促进先天性淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILC2s）释放细胞因子的主要因子，因此对AD 的发病有重要作用［8-9］。ILC2s 被激活后，分泌细胞因子IL-5、IL-9 和IL-13，其中IL-13 可诱导B 细胞产生IgE，间接活化肥大细胞（Mast cell，MC），IL-5 是嗜酸粒细胞的强趋化因子和增殖因子，而研究表明MC 在AD 患者皮损部位的数目多于非皮损部位，因此在AD 作用机制中，MC 扮演重要角色，而IL-5、IL-9 和IL-13 即是调控AD 的关键细胞因子，也对AD的发病有重要作用［8-10］，国内外研究均证实AD 患者IgE 以及T 辅助淋巴细胞Th2 型细胞因子水平明显增高［11］，AD患者为Th2 占优的过敏性疾病，Th2 分泌的IL-4 可促使B细胞产生IgE，Th1 分泌的IFN-γ 强烈抑制IgE 的合成［11］，但不同时期及不同程度皮损的AD 患者血清中细胞因子的表达水平有差别［12］，且在急性和慢性炎症皮损表达IL-4、IL-13 的细胞数显著高于正常人［13］。因此，降低AD 患者IgE 水平、抑制Th2 型细胞因子表达，逆转Th2 型免疫反应，有望成为AD 治疗的关键靶点。

表2 各组血清炎症因子水平比较（±s，n＝9）

表2 各组血清炎症因子水平比较（±s，n＝9）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

本研究中，模型组血清中IgE、IL-6、IL-13、IL-16、TNF-α 水平、皮层厚度、炎性细胞数较正常组均升高，而IFN-γ 较正常组水平降低；与模型组相比，在给予对叶豆浸膏治疗后，血清中IgE、IL-33、IL-6、IL-13 水平、皮层厚度、炎性细胞数都有明显下调，IFN-γ 的表达量有所增加，即说明Th1／Th2 免疫反应引发的双相性炎性皮肤病，在下调了Th2 细胞的分化，同时激活了Th1 细胞。提示对叶豆浸膏治疗AD 小鼠的作用机制可能是，通过促进IFN-γ分泌，降低IL-4 水平，同时抑制IgE 合成调节，Th1 分泌的IFN-γ 和Th2 分泌的IL-4 之间的平衡，使Th1／Th2 趋于平衡而发挥治疗作用。