丁香苦苷固体脂质纳米粒在小鼠体内的组织分布

张喜武，李秋晗，李永吉，刘美欣，徐坐帝，窦金金

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

丁香苦苷为木犀科丁香属植物紫丁香Syringa oblataLindl.的主要化学成分，是一种环烯醚萜类化合物［1-3］，具有抗炎、抑菌、抗病毒、强心、保肝［4-6］等作用。课题组前期发现，丁香苦苷对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）具有较好的疗效［7-8］，已授权发明专利，但由于其体内消除速度快、半衰期短等原因，导致疗效不理想，停药后病毒有反弹现象，故寻找合适的载体传递系统是解决问题的关键。

固体脂质纳米粒是以固态天然或合成类脂作为载体，将药物包裹于脂质核中形成的纳米粒给药系统，其生物相容性好，毒性低，具有延长药物作用时间、提高药物靶向性的双重作用［9-12］。课题组前期采用乳化蒸发法制备丁香苦苷固体脂质纳米粒，发现其T1／2、AUC 明显高于生理盐水，显示该成分经纳米粒包裹后半衰期明显延长，从而起到一定的缓释作用。为了明确该纳米制剂靶向作用，本实验采用小鼠尾静脉注射给药，通过HPLC 法测定丁香苦苷含有量，然后研究其组织分布，以期实现该成分高效精准地靶向治疗HBV。

1 材料

1.1 仪器 Waters 高效液相色谱仪（配置Waters 2996-2695 Empower 色谱工作站）；TGL-16C 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；WH-1 微型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；大龙微量移液器（北京智杰方远科技有限公司）；MP2000 电子天平（上海第二天平仪器厂）；BCD-221B／HC容声冰箱（海信科龙电器股份有限公司）；BF-2000 氮吹仪（北京八方世纪科技有限公司）。

1.2 试剂与药物 丁香苦苷对照品（黑龙江中医药大学自制，批号20170430，质量分数＞98%）；丁香苦苷原料药（黑龙江中医药大学自制，批号20170501，质量分数＞95%）。单硬脂酸甘油酯（批号20170324，湖南尔康制药有限公司）；卵磷脂（批号20170821，上海爱康精细化工有限公司）；F68（批号20171002，上海协泰化工有限公司）。甲醇为色谱纯（美国Dikma 公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物 昆明种小鼠，体质量（20±2）g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物使用合格证号SYXK（黑）2017-001。

2 方法与结果

2.1 丁香苦苷固体脂质纳米粒制备 采用乳化蒸发法。取单硬脂酸甘油酯约80 mg、卵磷脂约240 mg、丁香苦苷约10 mg，精密称定，加到5 mL无水乙醇中，加热使之完全溶解，作为有机相；取0.4%F68 溶液10 mL，水浴加热作为水相。在水浴温度65 ℃、搅拌速度600 r／min 条件下将有机相缓慢注入水相中，充分搅拌乳化1 h 后挥去乙醇，浓缩至约5 mL，得到半透明液体，迅速分散于5 mL稀释相中（0～2 ℃）搅拌1.5 h，即得。经测定，其平均粒径为（180.3±5.31）nm，Zeta 电位为－41.9 mV，PDI 为 0.138±0.013，包封率为（42.35±0.60）%，载药量为（5.33±0.03）%，具有良好的外观及稳定性。

2.2 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；Shimadzu 预柱（10 L×4.6 mm）；流动相甲醇-水（50∶50）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长221 nm；进样量20 μL。

2.3 组织分布研究

2.3.1 含药生理盐水制备 精密称取7.5 mg 丁香苦苷于25 mL 量瓶中，生理盐水溶解并定容，即得（0.30 mg／mL）。

2.3.2 冻干粉制备 取丁香苦苷固体脂质纳米粒溶液4 mL 于安瓿瓶中，加入0.7% 海藻糖，充分溶解后放入冷冻干燥机中，4 h 内降温至－40 ℃，保持3 h，待机器达到真空状态时2 h 内升温至－10 ℃，保持20 h，2 h 内升温至28 ℃，保持2 h，压塞，出箱，即得。经测定，其 平均粒径为（192.8±5.69）nm，Zeta 电位为－39.8 mV，PDI为0.150±0.010，包封率为（40.40±0.13）%，载药量为（5.03±0.4）%，再分散性及稳定性良好。

2.3.3 实验操作 60 只小鼠随机分成对照组与制剂组，每一时间点平行设定6 只，对照组尾静脉注射含药生理盐水，制剂组尾静脉注射“2.3.2”荐下冻干粉溶液，剂量均为15 mg／kg。给药后5、15、30、60、90 min 眼球取血，4 000 r／min 离心10 min，血浆于－20 ℃下保存。然后，断颈处死小鼠，迅速剖取心、肝、脾、肺、肾，生理盐水清洗血渍后滤纸吸干，置于－20 ℃下保存待用。

2.4 生物样品处理

2.4.1 血浆 精密吸取血浆样品100 μL，置于离心管中，将1 mL 蛋白沉淀剂丙酮加到含血浆样品的离心管中，涡旋混合1 min 后10 000 r／min 离心5 min，上清液在50 ℃氮气中吹干，200 μL 甲醇溶解剩余残渣，涡旋混合1 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤后置于样品瓶内衬管中，在“2.2”项色谱条件下进样测定。

2.4.2 组织 精密称取各组织质量后置于组织匀浆器中，按样品-生理盐水1∶2 比例进行匀浆，匀浆液吸取100 μL 放到1.5 mL 离心管中，加入1 mL 丙酮作为提取溶剂，涡旋混合1 min 后10 000 r／min离心5 min，上清液在50 ℃氮气中吹干，200 μL甲醇溶解剩余残渣，涡旋混合1 min，0.22 μm微孔滤膜过滤至内衬管中，在“2.2”项色谱条件下进样测定。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系制备 精密称取适量对照品于量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，得到1 mg／mL 贮备液，保存于4 ℃冰箱中，取0.001、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成0.10、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg／mL，取100 μL 用氮气吹 干，加 入100 μL空白组织匀浆液，涡旋混匀，得到0.10、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg／mL 组织样品溶液，按“2.4”项下方法处理，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 丁香苦苷线性关系Tab.1 Linear relationships of syringopicroside

2.5.2 专属性试验 制备空白、加药、给药后各组织样品，按“2.4”项下方法处理，在“2.2”项色谱条件下进样20 μL 测定，结果见图1。由此可知，无杂质干扰测定，方法专属性良好。

图1 丁香苦苷HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of syringopicroside

2.5.3 精密度试验 按“2.5.1”项下方法制备含1.0、40.0、80.0 μg／mL 丁香苦苷的血浆样品溶液，按“2.4”项下方法处理，在“2.2”项色谱条件下每天进样测定5 次，计算日内精密度；连续测定5 d，每天1 次，计算日间精密度，结果见表2。由表可知，各质量浓度下日内、日间精密度RSD 均小于10%，符合药动学研究要求。

2.5.4 提取回收率 按“2.5.1”项下方法制备3种质量浓度血浆样品溶液各5 份，按“2.4”项下方法处理，在“2.2”项色谱条件下进样测定，将所得峰面积与相同质量浓度标准液直接进样后的峰面积相比，作为提取回收率，结果见表3。

表2 丁香苦苷精密度试验结果（n＝5）Tab.2 Results of precision tests for syringopicroside（n＝5）

2.5.5 方法回收率 按“2.5.1”项下方法制备3种质量浓度血浆样品溶液各5 份，按“2.4”项下方法处理，在“2.2”项色谱条件下进样测定，将测定量与加入量进行比较以计算方法回收率，结果见表4。

表4 丁香苦苷方法回收率试验结果（n＝5）Tab.4 Results of methodology recovery tests for syringopicroside（n＝5）

2.5.6 组织分布 小鼠尾静脉注射给药后不同时间点各组织中药物质量浓度（公式为CiVi／Gi，其中Ci为匀浆液中药物质量浓度，Vi为各组织匀浆液体积，Gi为各组织质量）见图2，相对分布率（各组织中药物质量浓度／尾静脉注射总给药量×100%），见表5～6，1.5 h 内各组织中AUC 见图3。

图2 各组织样品药物浓度-时间图Fig.2 Drug concentration-time diagrams of samples in various tissues

表5 尾静脉注射含药生理盐水后丁香苦苷相对分布率Tab.5 Relative distribution percentages of syringopicroside after tail intravenous injection of medicated normal saline

表6 尾静脉注射固体脂质纳米粒溶液后丁香苦苷相对分布率Tab.6 Relative distribution percentages of syringopicroside after tail intravenous injection of solid lipid nanoparticles

由图2 可知，尾静脉注射固体脂质纳米粒溶液10、30、50、70、90 min 后肝脏中含药量分别为（62.42±1.23）、（37.31±1.23）、（16.92±2.19）、（8.36±2.44）、（3.71±0.89）μg／g，是含药生理盐水的1.76、2.64、1.82、1.54、3.86 倍。由表5～6 可知，与含药生理盐水组比较，虽然丁香苦苷固体脂质纳米粒组织分布趋势无明显变化，但各组织相对分布水平有所改变。由图3 可知，尾静脉注射给药后丁香苦苷分布在血浆、心、肺中略有减少，脾、肾中有所增加，肝中明显升高。

图3 1.5 h 内各组织中AUCFig.3 AUCs in various tissues within 1.5 h

2.6 靶向性评价 选择相对摄取率和靶向效率作为评价指标来衡量制剂组织靶向性，公式分别为相对摄取率＝（AUCi）np／（AUCi）s、靶向效率＝AUC靶向／AUC非靶向，其中i 表示组织，np 表示纳米粒，s 表示溶液。相对摄取率越高，靶向性越好，其大于1 表示纳米粒在该组织中具有靶向性；靶向效率越高，选择性越强，其大于1 表示纳米粒对靶组织更有选择性。另外，以纳米粒与溶液靶向效率的比值为靶向增强倍数。

表7 显示，丁香苦苷在肝中的相对摄取率明显高于其他组织中，即具有肝靶向性；固体脂质纳米粒、含药生理盐水在肝中的靶向效率均大于1，靶向增强倍数为1.84，表明前者对该组织的选择性强于后者。

3 讨论

在测定各组织中丁香苦苷含有量时发现，血浆中静脉注射丁香苦苷固体脂质纳米粒溶液、生理盐水时初始时间点浓度差距较大，后者明显降低。这是由于药物制成纳米粒溶液后具有靶向作用，大部分富集于肝，导致血浆中游离药物浓度下降。

表7 各组织中丁香苦苷靶向性参数（n＝5）Tab.7 Targeting parameters for syringopicroside in various tissues（n＝5）

体内分布研究结果表明，相对摄取率为1.65，表明丁香苦苷固体脂质纳米粒在肝中有良好的靶向性，能明显提高该成分肝分布；固体脂质纳米粒组对肝脏的靶向性明显高于生理盐水组，表明该剂型经静脉注射后能很快聚集于肝，从而达到肝靶向的目的，并增强药物选择性。同时，丁香苦苷固体脂质纳米粒在肝中的相对分布率为55.02%，明显高于血浆、心、脾、肺、肾中，表明它具有肝富集的趋势。

被动靶向主要通过巨噬细胞内吞、融合等作用被巨噬细胞摄取，HBV 属于嗜肝性病毒，在肝实质细胞内复制传代，制成纳米制剂后能将药物靶向于肝细胞，有望从病灶上根除，从而彻底治愈疾病［13］。粒径大小决定靶向制剂靶向脏器的不同位置［14-15］，本实验所制备的丁香苦苷固体脂质纳米粒粒径在200 nm 左右，推测靶向位置可能在肝组织内，而并非是实质肝细胞。丁香苦苷抗HBV 效果显著，但如欲彻底清除后者，则纳米靶向制剂粒径应控制在100 nm 以内，故降低粒径或表面修饰探针以制成主动靶向制剂是今后研究的重点。