分子检测在甲状腺结节良恶性诊断中的研究进展

韩晓娜，罗晓茂

(昆明医科大学第三附属医院超声医学科，昆明 650118)

近年来全球范围内甲状腺癌的发病率快速上升，根据美国国家癌症研究所的调查显示,1975年甲状腺癌的发病率为4.85/10万人，而2012年为14.90/10万人[1]。中国甲状腺癌的发病率也呈上升趋势，特别是沿海地区[2]，根据2018年我国国家癌症登记中心发表的截至2014年的数据显示，甲状腺癌在女性癌症中居第四位，位于乳腺癌、肺癌及结直肠癌之后[3]。其发病率的增加在很大程度上归因于超声等影像学检查设备的改进和体检的普及，导致甲状腺微小乳头状癌(肿瘤大小<1 cm)的检出率增加。甲状腺结节是临床的常见病变，临床医师需对甲状腺结节的恶性风险进行分层，最主要的内容就是区分结节的良恶性，进而指导患者的下一步诊疗(随访、活检或手术)。超声引导下细针穿刺细胞学(fine needle aspiration，FNA)对甲状腺结节诊断的作用甚至可以媲美甲状腺活组织检查，但仍有25%～30%的FNA样本诊断不明确，这一部分为“不确定细胞学”，即意义不明的非典型或滤泡状病变 (FNA Ⅲ类)和滤泡状肿瘤或可疑滤泡状肿瘤(FN/FNA Ⅳ类)，以上均有不能忽略的恶性风险(10%～30%和25%～40%)[4-5]。在一项Meta分析中，在所有切除的结节中，1/3为恶性肿瘤，1/2为FNA不确定结节，其中67%的结节术后证实为良性[6]。而过度治疗将导致患者面临短期和长期的手术并发症，部分患者面临终身甲状腺激素替代治疗。以上情况为一些分子检测技术的发展奠定了基础。近年来，对甲状腺肿瘤的分子病理学研究已经比较清楚，随着下一代DNA和RNA测序技术的引入，分子病理学技术取得了重大进展。目前，分子检测可以在FNA的基础上提高甲状腺结节术前诊断的准确性，更准确地划分结节的恶性风险，特别是能优化FNAⅢ和FNAⅣ类结节的恶性风险分层，以避免对良性结节进行不必要的手术处理，并防止恶性结节的再次手术。多分子联合诊断可大大提高诊断的准确率,为患者提供更好的预后管理。现就目前分子检测技术在甲状腺结节诊断和预后方面的应用予以综述。

1 BRAF V600E突变

BRAF V600E是甲状腺癌中最常见的基因突变。研究发现，BRAF突变发生在35%～65%的乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)病例中[7-8]。BRAF V600E测试可以帮助明确不确定结节的性质，为不确定结节的诊断提供一种更具成本效益的方法，尤其是在缺乏复杂分子测试的地区。有证据表明，BRAF V600E突变可能与预后较差和更有侵略性的肿瘤行为有关，如甲状腺外浸润、淋巴结转移和复发[9]。此外，BRAF V600E突变被证明是PTC复发的一个独立预测因子，并与癌症相关死亡率的增加有关[10]。该突变可指导PTC的诊断和治疗方案的选择[11]。有研究对BRAF V600E突变进行了评估，结果显示，其对非典型或滤泡性病变、滤泡性肿瘤和可疑滤泡性肿瘤的阳性预测值(positive predictive value，PPV)分别为88%、87%和95%[12]。在一项包含581例BRAF阳性病例的荟萃分析中，580例为PTC，经FNA检测BRAF阳性结节的恶性率为99.8%[13]。尽管BRAF V600E具有较高的特异性，但单凭BRAF V600E突变不太可能提供甲状腺癌变的全貌，因此BRAF V600E突变作为不确定结节的单一筛选指标价值有限，与其他甲状腺癌相关基因突变结果进行整合可能会提高诊断效能。

2 RAS突变

RAS突变在其他系统肿瘤中被认为是致癌的，但在甲状腺结节中的作用存在争议，因为RAS突变在良恶性病变中均有发现。RAS突变是甲状腺癌第二大常见突变，由于点突变引起RAS蛋白质本构激活会导致异常信号和途径的活化，从而导致潜在的肿瘤形成，并向恶性转化[14]。RAS突变(HRAS、NRAS和KRAS)常与滤泡状甲状腺癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)相关，是FTC最常见的突变，在FTC中的发生率为40%～50%[15]。Lee等[16]的研究发现，术后确诊为滤泡型甲状腺乳头状癌(follicular variant of papillary thyroid carcinoma，FVPTC)的病例中，术前细胞学诊断为FNAⅡ类的结节RAS突变率为67%,FNAⅢ类为56%和FNAⅣ类为63%。以上数据表明，RAS突变分析可作为一个术前辅助测试以降低假阴性率。RAS突变可以鉴别风险较低的结节，并可作为潜在恶性肿瘤的标志物。大部分存在RAS突变体的恶性肿瘤为FVPTC，尤其是包膜性和非侵袭性滤泡型甲状腺肿瘤，其恶性潜能非常低，通常在腺叶切除术后不建议行进一步的治疗[15，17-19]。即使组织学检查为良性滤泡型腺瘤，因RAS突变引起的潜在恶性转化风险也是接受手术治疗的原因之一，因此对甲状腺结节进行RAS分析可以为患者提供更个性化的治疗建议。

3 RET/PTC重排

RET原癌基因编码酪氨酸激酶受体蛋白，该蛋白仅存在于甲状腺的癌旁C细胞，通常作用于细胞膜，使细胞表面受体蛋白不被甲状腺滤泡细胞表达。当一个基因的一个特定区域与另一个供体基因的一个区域互换时就会发生重排，RET基因与另一种不相关的基因融合形成RET/PTC重排。在10%～20%的PTC中可观察到RET/PTC重排，目前已发现15种RET/PTC重排类型，包括RET和10种不同的基因，其中RET/PTC1和RET/PTC3与PTC的关系密切，并与是否存在放射性接触密切相关[20-21]。Rabes等[22]对191例幼年时暴露于切尔诺贝利反应堆的PTC患者进行研究发现，有62.3%的患者存在RET基因重排，其中PTC3明显多于PTC1，辐射导致儿童PTC中RET基因重排比例很高。在癌症基因组图谱中发现，在484例PTC患者中有15.3%存在RET/PTC重排[23]。与RET/PTC重排阴性结节相比，RET/PTC阳性结节的生长速度更快；与其他突变的甲状腺癌相比，PTC合并RET/PTC重排具有较高的局部延伸率和淋巴结累及率[24]。RET/PTC重排阳性影响促甲状腺激素的治疗效果，有可能成为一种可以评价促甲状腺激素疗效的指标。甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)占甲状腺恶性肿瘤的2%～4%，在95%以上的病例中，髓样癌常表现出RET/PTC易位，RET基因突变是MTC预后不良的重要指标[25]。考虑到RET/PTC重排在良性结节中也能观察到，因而其并不是诊断PTC的特异性指标，所以RET/PTC重排作为PTC预后标志物仍存在争议。

4 配对盒基因8抗体-过氧化物酶体增殖物激活受体

配对盒基因8抗体(pairing box gene 8 antibody,PAX8)基因编码是一种有助于甲状腺滤泡细胞形成的转录因子，PAX8驱动许多甲状腺特异性基因的表达，如甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)γ是核受体家族转录因子之一,是脂肪生成的主要调节因子，同时也是全身脂质代谢和胰岛素敏感性的有效调节因子[26]。PAX8与PPARγ基因的融合被认为是FTC进展早期的一种突变[27-29]。PAX8-PPARγ融合基因在30%～35%的FTC以及一些滤泡性变异PTC中发现，也见于一些滤泡型腺瘤，该融合基因导致PAX8-PPARγ融合蛋白产生，阳性提示结节恶性风险高且需要手术治疗，其为FNA不确定结节的性质及手术提供了证据[26]。年轻FTC患者PAX8-PPARγ阳性的特点是肿瘤呈实性，易侵犯血管。另外，在滤泡型腺瘤中虽然检测到PAX8-PPARγ阳性率较低，但仍需要进行组织病理学检查。因此，识别PAX8-PPAR融合蛋白(以及其他驱动突变)是改善甲状腺结节活检结果不确定患者临床决策的一个有效方法。

5 基因组检测

美国甲状腺协会和欧洲甲状腺协会指南均提出，术前FNA为Ⅲ、Ⅳ类者考虑检测BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8-PPARγ等基因[30-31]，BRAF、RAS、RET/PTC和 PAX8-PPARγ基因的改变可见于70%甲状腺癌[32]，这已在组织学上证实。一项前瞻性研究比较了细胞学联合RET/PTC、BRAF、PAX8-PPARγ和RAS等突变分子检测，结果显示，联合检测使FNA对恶性甲状腺结节的灵敏度从44%提高至80%[33]。另一项研究将细胞学与分子检测(检测细胞学上PAX8-PPARγ、BRAF、RAS和RET突变)相结合，诊断恶性肿瘤的灵敏度从60%提高至90%[34]。以上研究表明，突变的存在可以很好地预测恶性肿瘤的发生。甲状腺结节的FNA检测到PTC和FTC的几种基因突变，可用于改善甲状腺结节患者的癌症诊断和治疗，但是这些基因突变单独诊断的价值有限，需要进行联合测试以获得更准确的诊断和预后信息，因此衍生出了基因组检测，这是目前对 FNA Ⅲ、Ⅳ类结节最有力的分子诊断，这些突变中的任何一个均可为甲状腺恶性肿瘤的诊断提供强有力的指示，并帮助Ⅲ、Ⅳ类结节改善临床管理。

6 The Afirma基因表达分类器

The Afirma基因表达分类器(gene expression classifier，GEC)是一种检测142个特定基因相关信使RNA的表达以诊断不确定结节的专用测试[35]，这个测试对不满足手术条件的FNA不确定结节非常有用，如结节太小、患者拒绝手术或无症状甲状腺肿。目前GEC是美国应用最广泛的分子检测方法，有助于临床医师对甲状腺FNA Ⅲ类、Ⅳ类结节进行手术或随访[36]。有医疗机构使用GEC进行FNA Ⅲ类和Ⅳ类结节的排除测试，良性结果意味着患恶性肿瘤的风险为5%～6%，该机构的The Afirma GEC总灵敏度为95.7%，总特异度为30.5%[37]。另有研究显示，在Ⅳ类结节中，GEC检测具有较高的阴性预测值(negative predictive value，NPV)，可将恶性肿瘤的风险降低至5%～6%，等同于活检为良性[25]，因此对于FNA Ⅳ类结节，GEC检测为良性则无需手术。除此之外，2014年添加了Afirma MTC和Afirma BRAF这两个信使RNA分类器，用于识别髓样癌[38]和BRAF[39]的基因表达特征。截至目前，有研究表明GEC的灵敏度(98%)、特异度(>99%)、PPV(98%)、NPV(>99%)均非常高，但仍需进一步验证[40]。甲状腺髓样癌并不常见，对于其FNA诊断的准确率相对较低，尤其是与嗜铬细胞瘤相关时，Afirma MTC作为髓样癌的术前检测有很大的发展空间和潜力。综上所述，对于GEC结果良性和细胞学结果良性的结节可进行类似的临床管理。

7 下一代测序

下一代测序(nextgen sequencing,NGS)是一种较为准确、灵敏的基因测序方法，与Sanger测序等传统测序方法相比，NGS允许高通量的多基因同步目标测序，只需要非常少的DNA，在总体上是更经济有效的方法。

7.1ThyroSeq Nikiforova等[40]制订了一个NGS检测小组，即初代ThyroSeq:将已知与甲状腺癌发生有关的12个基因中的284个突变热点作为对象，该检测包括已知与甲状腺癌相关的最常见突变以及潜在侵袭性肿瘤的标志物，如肿瘤蛋白53 (tumor protein 53，TP53)和端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)[40]。一项关于247例FNAⅣ类甲状腺结节患者的初步研究报道了ThyroSeq的性能参数，包括灵敏度(57%)、特异度(97%)、准确度(86%)、NPV(86%)和PPV(87%)[12]。Moore等[41]认为，即使等位基因频率低至3%时，ThyroSeq仍能提供突变等位基因的定量评估。对于具有“阳性”ThyroSeq结果的结节，突变的类型和组合可以预测癌症的发生率，也可以评估癌症风险。因此，结合临床表现可能有助于医师选择最合适患者的手术方式。

7.2Thyroseq v2.0 Thyroseq v2.0可用于检测14个基因中的点突变和小插入/缺失、42种基因融合、16个基因表达水平的改变，对于这些基因改变的选择是基于对90%的乳头状癌和其他甲状腺癌的突变热点和基因融合的分析[23]。TERT和TP53突变是无病生存的独立预测因子。TP53突变发生在肿瘤进展晚期，最常见于低分化和间变性甲状腺癌，这些甲状腺癌起源于分化良好的PTC[42]。TERT突变与FTC和FVPTC有关，并与更具侵袭性的行为有关[43]。Xu等[44]证实了TERT突变与远处转移的关系，并认为TERT可能是更可靠的长期预后预测因子。甲状腺癌最差的分子检测结果为BRAF和RAS突变合并TERT、TP53、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α或蛋白激酶B1突变[45-46]，存在这种突变的肿瘤可能受益于甲状腺全切。Nikiforov等[47]用Thyroseq v2.0检测143例FNAⅣ类甲状腺结节患者发现，其灵敏度为90%，特异度为93%，PPV为83%，NPV为96%。Nikiforov等[48]用ThyroSeq v2.0评估了465例FNAⅢ类甲状腺结节患者，结果显示，Thyroseq v2.0的特异度为92.1%，灵敏度为90.9%，准确度为91.8%，PPV为76.9%，NPV为97.2%。由于Thyroseqv2.0的高灵敏度以及在癌症检测中表现出较高的PPV，Thyroseqv2.0可作为细胞学不确定结节的“rule-in”和“rule-out”检验[37],Thyroseqv2.0在ThyroSeq的基础上不仅提高了鉴别甲状腺良恶性结节诊断的准确率，也可用于发现甲状旁腺疾病。

7.3ThyroSeq v3.0 ThyroSeq v3.0检测扩大了ThyroSeq v2.0检测的面板，检测了112个基因的DNA或RNA，包括ThyroSeq v2.0中所有的基因，并检测12 135个单核苷酸变异、插入和缺失，超过120种基因融合,19种基因表达水平的改变,FNA样品中10个基因组区域拷贝数的变化，组织样本中的27个基因组区域[37],同时也提高了检测Hurthle细胞病变的准确性[49]。ThyroSeq v3.0检测对Hurthle细胞良恶性病变的灵敏度为92.9%，特异度为69.3%[37]。对224例FNAⅢ和Ⅳ类病例的研究显示，ThyroSeq v3.0检测的灵敏度为94%，特异度为82%，其最大优势在于NPV达97%以上[50-51]，这意味着检查结果为阴性时，诊断性手术的必要性大大降低，与现有的分子检测相比进一步提高了癌症检测的灵敏度。此外，ThyroSeq v3.0也保留了准确检测甲状腺髓样癌和甲状旁腺结节的功能。

8 微RNA分析

基于微RNA(microRNA,miRNA)的分析方法被称为RosettaGX Reveal，是一种商业上可用的方法，其将不确定的甲状腺结节分为良性、可疑恶性或恶性。miRNA是一种小型的非编码RNA，长度约为23个核苷酸，miRNA的失调可能导致包括甲状腺癌在内的多种实体肿瘤的发生和进展。Yu等[52]发现，PTC患者的血清中有3种miRNAs(let-7e、miR-151-5p和miR-222)，与健康受试者和良性结节患者相比存在明显的过表达。研究表明，miRNA分析诊断FNA Ⅲ～Ⅳ类甲状腺结节的灵敏度为100%，特异度为80%[53]。

Cantara等[54]首次对白种人分化型甲状腺癌或良性甲状腺肿患者及健康人血清中miRNA的表达谱进行了分析，结果发现，在白种人甲状腺结节病患者的血清中miR-190和miR-95联合可以准确识别恶性风险高的结节。Pilli等[55]认为，血清miR-95和miR-190联合检测是一种准确、无创的甲状腺结节鉴别诊断工具。基于miRNA的分子检测通常是多种分析和(或)临床性能特征的组合，很大程度上能指导患者避免不必要的手术。

ThyGenX TEST使用七基因小组(BRAF、KRAS、NRAS、HRAS、RET/PTC1、RET/PTC3、PAX8/PPARγ)为平台,增加了对磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α基因的分析，并使用NGS平台识别超过100个与甲状腺恶性肿瘤相关的基因改变，只有被诊断为Bethesda Ⅲ类和Ⅳ类的病例才能接受ThyGenX分析。而ThyraMIR测试则是基于分析10种不同miRNAs的一项测试,这10个miRNAs包括miR-29b-1-5p、miR-31-5p、miR-138-1-3p、miR-139-5p、miR-146b-5p、miR-155、miR-204-5p、miR-222-3p、miR-375、miR-551b-3p[56]，ThyGenX检测结果为阴性时，miRNA检测能正确识别出ThyGenX突变阴性标本中64%的恶性病例和98%的良性病例[57]。研究表明，miRNA分子参与甲状腺异常的细胞周期进展、分化和增殖，在FNA Ⅲ类和Ⅳ类结节中miRNA具有潜在的诊断价值[58]。Interpace公司提倡ThyGenX和ThyraMIR结合使用对FNA Ⅲ和Ⅳ类不确定结节进行进一步诊断，与ThyGenX联合使用时，ThyraMIR诊断不确定FNA样本的特异度为89%，灵敏度为85%，NPV为94%,PPV为74%；在32%的癌症患病率中，61%的分子结果为良性，NPV为94%，PPV为74%，当两项测试结果均为阴性时，在潜在恶性率为32%的环境中，这种情况剩余的癌症风险非常低(6%)，若排除癌症患病率的影响，相较GEC，该测试将真实的良性结果提高了65%，并将可避免的诊断性手术率降低了69%[56]。基于多平台和RNA检测具有较高的PPV和NPV，对阳性(恶性)结果的患者可以进行手术治疗，而阴性(良性)结果的患者可以采用积极随访这种更保守的治疗方法而不进行手术治疗。虽然目前全球已有很多研究数据说明上述分子检测平台对甲状腺结节的良恶性诊断有重要作用，但为了确定ThyGenX和ThyraMIR平台如何有效和准确区分良性和肿瘤性甲状腺结节，仍需进一步临床验证。

9 展 望

FNA和分子检测的目标均是为了提高甲状腺结节诊断和预后评估的准确性，以及协助临床医师在术前更有效的管理甲状腺结节。甲状腺分子检测是一个快速发展的领域，分子检测降低了不确定甲状腺结节的手术率，在减少甲状腺结节诊断的不确定性方面显示出巨大的潜力。上述大部分检测方法在术前均可以利用小样本的DNA、RNA或从FNA抽吸物中提取的miRNA进行检测。

分子检测已从单基因检测发展到小型、大型的多面板突变分析，实现高NPV仍然是分子测试的一个关键目标。不同的检测方法有其各自的优势和局限性，这些分子检测技术最显著的局限性为分子检测结果为良性的甲状腺结节很少被切除，缺乏长期的随访，因此在临床实践中这些检查的假阴性率未知。目前使用分子检测指导治疗的数据仍不够充分，建议进行更多来自更大样本和更长随访时间的队列研究，同时强烈建议密切监测分子检测结果为阴性的结节。基因改变是导致患者患恶性肿瘤的众多因素之一，尽管分子检测有助于甲状腺结节管理，但现临床上仍不能单独以分子检测的结果来诊断结节的性质。因此，分子检测应始终与细胞学、临床和超声检查结果相结合。虽然目前甲状腺癌的分子诊断学尚未完全了解，但在这一领域所取得的显著进展拓宽了甲状腺癌的诊断、治疗和预后的视野。