钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ及其抑制剂在心力衰竭中的研究进展

曲悦，马丹，刘凤岐

(哈尔滨医科大学附属第一医院内科危重症病房，哈尔滨 150001)

心力衰竭(heart failure，HF)是多种原因导致的心脏结构和(或)功能的异常改变，使心室收缩和(或)舒张功能发生障碍引起的一组复杂临床综合征。HF的复杂病理生理变化涉及钙离子(Ca2+)的改变、基因表达的改变和信号转导途径的干扰等。而心肌细胞中钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的慢性激活可进一步加重心肌损伤，这种激活在病理性心脏重构和HF的发生、发展中起重要作用。CaMKⅡ是一种分布广泛的多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它调节许多生物学过程，包括Ca2+稳态、膜兴奋性、细胞周期进程、蛋白质分泌、细胞骨架组织、学习、记忆和基因表达等[1-2]。在心脏中，CaMKⅡ还与兴奋收缩偶联、基因转录及细胞凋亡有关[2]。通过对CaMKⅡ的深入研究，人们发现在动物模型和心脏病患者中，CaMKⅡ的表达水平和活性在不同的心肌应激状态和不同的心脏疾病中均有所升高[3]，表明CaMKⅡ在HF、心律失常等心脏疾病中起重要作用，用具有适当选择性的抑制剂靶向抑制心脏中CaMKⅡ的活性可能为治疗HF和心律失常的一种新方法，为开发新型药物提供了新思路。现就CaMKⅡ及其抑制剂在HF中的研究进展予以综述。

1 CaMKⅡ的生物学特点

CaMKⅡ属多基因家族，有4个不同的基因分别编码α、β、γ和δ亚基[4]；心脏内的CaMKⅡ以δ亚型为主，有CaMKⅡδB和CaMKⅡδC两种不同的剪接体，其中CaMKⅡδB主要参与基因的表达调控，而CaMKⅡδC主要参与Ca2+依赖的信号转导途径[5-6]。CaMKⅡ参与调控某些基因的表达和细胞分化凋亡，是推动细胞周期各时相顺利进行、调控细胞生长增殖的重要分子；此外，CaMKⅡ还是心肌细胞Ca2+稳态调节的关键蛋白之一，主要通过肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)上的兰尼碱受体(ryanodine receptor，RyR)和受磷蛋白(phospholamban，PLB)来调节钙信号，并在生理条件下维持心脏正常电生理活动和收缩功能[7]。

CaMKⅡ全酶由8～12个单体组成，各亚基借结合域连接形成齿轮状结构；每个CaMKⅡ亚基包含3个不同的单元域，即N端催化域、含自我抑制位点和钙/钙调蛋白(Ca2+/calmodulin，Ca2+/CaM)结合位点的中间调节域以及C端的结合域[8-10]。在基础状态下，CaMKⅡ的催化域与调节域的假底物区结合，阻止底物和镁离子(Mg2+)/ATP与催化域结合，使CaMKⅡ处于自身抑制状态而无活化；收缩期时细胞内Ca2+浓度增加，大量Ca2+与CaM结合形成Ca2+/CaM复合物，结合到CaMKⅡ的调节域上，使CaMKⅡ构象发生改变，调节域对催化域的自动抑制作用解除，催化域从假底物区释放，发挥生理作用，激活CaMKⅡ全酶，并依次磷酸化细胞中的靶蛋白，包括RyR、PLB、SR钙ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)和L型钙通道等，从而发挥生物学活性[1,8-10]。随着Ca2+/CaM解离，CaMKⅡ失活，这是最先发现的经典激活方式，称为Ca2+/CaM依赖性CaMKⅡ激活；此外，CaMKⅡ的活性也可以通过翻译后修饰来调节，称为非Ca2+/CaM依赖性CaMKⅡ激活，包括磷酸化、氧化、S-亚硝基化[11]，糖基化[12]，α-辅肌动蛋白[13]激活和尚未完全解析的环腺苷酸活化交换蛋白/一氧化氮合酶途径[14]。

2 CaMKⅡ在HF后心律失常中的作用

除泵衰竭外，HF患者的另一个重要死因是心律失常(心源性猝死)，且房性和室性心律失常均可加速HF的进展[15]。神经体液、代谢、电生理特性等的动态变化和密切相互作用使HF患者易患心律失常[16]。因此，研究CaMKⅡ与HF后心律失常之间的关系具有重要的临床意义。

CaMKⅡ对RyR的过度磷酸化可导致SR的自发性Ca2+释放事件(Ca2+-泄漏)增加[17-18]。生理条件下，SERCA不仅可以将Ca2+转运回SR，还可以通过PLB的CaMKⅡ依赖性磷酸化来增强SERCA的功能；然而在病理条件下，由于SR过量的Ca2+-泄漏，舒张期细胞质中[Ca2+]浓度增加，激活了钠钙离子交换体(sodium-calcium exchange，NCX)，从而导致延迟去极化[18]。同时，CaMKⅡ还可以使作为钠电流(INa)基础的钠通道Nav1.5磷酸化，从而增加晚期钠电流(INaL)[19]，这可以增加细胞质[Na+]浓度，限制Ca2+通过NCX流出，引起继发于Na+过载的Ca2+过载。Mason和Sossalla[20]也指出，这种增加的[Ca2+]可以诱导SR Ca2+-泄漏，激活NCX，导致延迟去极化。延迟去极化是心房和室性心律失常的已知触发因素[21]。此外，HF中上调的CaMKⅡ也是长QT-3型和儿茶酚胺能多形性室性心动过速这两种遗传相关心律失常综合征的主要分子缺陷[22]。

上调的CaMKⅡ与受干扰的Na+和Ca2+通量之间的致心律失常协同作用在衰竭的室性和房性心肌细胞中均已被假设，且心肌细胞电生理、Ca2+-和Na+-处理以及信号转导的计算模型已开始定量证实这一观点[23-24]。CaMKⅡ活性增加会使INaL升高[19]，而升高的INaL可延长动作电位持续时间并增强早期去极化的倾向，这是一种众所周知的心律失常触发因素。而更长的动作电位和更短的心脏舒张会导致Na+和Ca2+超负荷，这会增加自发性SR Ca2+-泄漏和延迟去极化后的可能性；这种Ca2+负载也促进了CaMKⅡ活化，加强了INaL和RyR过度活化，进一步延长了动作电位，增加了Na+和SR Ca2+负荷和泄漏，最终产生病理性正反馈回路，促进机械性心脏功能障碍(收缩和舒张)和心律失常[22]。因此，可以通过抑制CaMKⅡ活性阻断CaMKⅡ-Na+-Ca2+正反馈环，从而达到治疗和预防HF后心律失常的目的。

3 CaMKⅡ在HF中的作用

CaMKⅡ已经被证明在多种心脏疾病中扮演重要角色，尤其是HF[3]。CaMKⅡ的过度活跃和慢性激活是病理性心脏重构的确定因素，且在HF期间可以直接影响心脏收缩功能障碍及心律失常的发生和发展[25-27]。Zhang等[25]通过给小鼠行主动脉缩窄术制造HF模型，并用小鼠左心室标本行进一步研究，结果表明，CaMKⅡδC的表达、磷酸化和信使RNA水平均增加，即CaMKⅡδC活性在HF中增高且始于转录阶段；同时，研究者还制造了CaMKⅡδC的转基因小鼠(TG小鼠)，一段时间后这些TG小鼠的CaMKⅡ活性增加了1.7～3倍，左心室短轴缩短率降低了65%，大多数小鼠表现出肺淤血、胸腔积液、严重水肿等HF的症状，并最终出现了心脏扩张性肥大和心室功能障碍，小鼠寿命缩短；此外，从TG小鼠心脏分离出的心肌细胞体积增大、收缩力降低，且CaMKⅡ位点的PLB和RyR磷酸化增加。这些结果证明了CaMKⅡδC在心脏中的过度表达可诱导心脏肥大和扩张型心肌病的发生。Maier等[26]进一步观察了TG小鼠和野生型同窝小鼠(WT小鼠)心肌细胞中Ca2+调节的改变，结果发现：①与WT小鼠相比，TG小鼠的抽搐时间缩短，舒张性[Ca2+]i、[Ca2+]i瞬变振幅和SR Ca2+含量均降低，这与SERCA2表达减少、SR Ca2+-泄漏增加及NCX表达增加一致；②在TG小鼠中抽搐/咖啡因[Ca2+]i(一个SR Ca2+释放分数的指数)显著增加，因此虽然SR Ca2+的含量降低，但抽搐期间释放的SR Ca2+比例增加；③与WT小鼠相比，TG小鼠的SR Ca2+含量较低，但其舒张期Ca2+火花频率(SR Ca2+-泄漏的量度)和抽搐分数释放增加(火花持续时间延长)，表明TG小鼠的RyR发生功能改变且舒张期SR Ca2+-泄漏增加；④咖啡因诱导[Ca2+]i瞬变降低得更快，表明TG小鼠相较WT小鼠增强了NCX功能，这也与增加的NCX蛋白表达相一致，即CaMKⅡ过度表达后引起激发-收缩偶联的急性调节，使NCX表达增加、SERCA2表达减少、SR Ca2+含量降低以及SR Ca2+-泄漏增加，造成TG小鼠心肌细胞收缩功能降低，最终导致HF。

4 CaMKⅡ抑制剂

已有研究表明，抑制CaMKⅡ可以预防病理性心肌重构和结构性心脏病，CaMKⅡ受到抑制后相关蛋白的表达水平和功能均会发生改变[28]。Liu等[29]进行了猪心房颤动-HF模型实验，每组动物随机接受编码CaMKⅡ抑制肽的腺病毒或0.9%氯化钠注射液的心房基因转移，研究直接评估了CaMKⅡ在心房结构重构中的作用；实验数据显示，CaMKⅡ的水平和活性在心房颤动-HF早期逐渐升高，且介导了心房颤动时心房收缩功能和结构重构相关的信号通路，同时抑制CaMKⅡ可维持心房收缩功能，减轻心房肥厚、纤维化和凋亡，但不影响炎症和肌溶解。这证明抑制CaMKⅡ可减少HF患者的心房重构，并可预防心房颤动的发生。CaMKⅡ的抑制还可以防止过度β肾上腺素受体刺激和心肌梗死后的适应性不良重构，可显著减轻心肌梗死小鼠心肌肥厚以及心肌纤维化的程度，改善心肌细胞钙稳态，缩短心脏细胞动作电位[28]。此外，抑制CaMKⅡ还可改善衰竭心肌细胞SR Ca2+等引起的心脏触发活动，减少HF后心律失常的发生[30-31]。

4.1变构抑制剂 迄今为止使用最广泛的CaMKⅡ抑制剂为KN93，它是CaMKⅡ活性的变构抑制剂。研究表明，KN93直接与Ca2+/CaM结合会破坏Ca2+/CaM与CaMKⅡ相互作用的能力，从而有效抑制CaMKⅡ的活化[32]。然而，一旦CaMKⅡ激活并自磷酸化，KN93则无法抑制该激酶。He等[33]给主动脉缩窄术后的HF小鼠每天腹腔注射KN93或KN92(KN93无活性类似物)(共1周)慢性抑制CaMKⅡ，并使用蛋白质印迹法评估小鼠心室中的总CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ水平，结果发现，HF组小鼠心室中的总CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ水平均升高，且磷酸化CaMKⅡ占总CaMKⅡ的比例增加超过3倍(P<0.05)，而HF+KN93组小鼠心室中CaMKⅡ的磷酸化水平降低了48%；他们进一步比较了超声心动图、压力-体积循环分析的各项数值变化，结果表明，慢性抑制CaMKⅡ的活性能使左心室射血分数、收缩末期压力容积关系、压力上升-舒张末期容积峰值速率和前负荷补充搏功均增加，而对峰值压力下降率、弛豫时间常数和舒张末期压力-体积关系无显著影响；同时，慢性抑制CaMKⅡ的活性也可显著增加异丙肾上腺素作用后HF小鼠的左心室射血分数、收缩末期压力容积关系和前负荷补充搏功值等的数值。该实验结果证明了慢性抑制CaMKⅡ活性既能显著改善HF小鼠的心功能和HF小鼠对异丙肾上腺素的反应性，又不损害其心脏的舒张功能。截至目前，大多数CaMKⅡ抑制剂的数据均来源于体外细胞实验，He等[33]进行的是第一项实际检测CaMKⅡ抑制剂治疗对整体实验动物HF心脏影响的实验，这对将CaMKⅡ抑制剂应用于HF的临床具有重要的指导意义。

4.2小分子抑制剂 AS105是Allosteros Therapeutics公司通过对嘧啶类CaMKⅡδ抑制剂进行优化后推出的高亲和力小分子ATP竞争性CaMKⅡ抑制剂[34]。Neef等[35]使用来自人类供体的心房肌细胞和CaMKⅡδC过度表达的HF小鼠的心室肌细胞探索了AS105的治疗潜力，结果发现，AS105减少了人类供体心房肌细胞的SR Ca2+-泄漏和小鼠心室肌细胞的SR Ca2+-泄漏，且在人的心房肌细胞中，AS105显著降低了致心律失常的自发性SR Ca2+释放事件的可能性；在HF小鼠的心室肌细胞中，AS105增强了SR积累Ca2+的能力，表现为小鼠细胞中Ca2+-瞬时振幅的静息后电位增强，SR Ca2+-含量增加，因此这些心肌细胞在基础刺激期间的收缩能力得到改善且不会对激发-收缩偶联产生负面影响。该研究表明了AS105对CaMKⅡ的抑制是通过ATP竞争发生，与通常使用的KN93不同，AS105同样可以很好地抑制未磷酸化和自磷酸化的CaMKⅡ，这种抑制多种形式CaMKⅡ的潜力使AS105有望在临床治疗中广泛应用。

GS-680是高选择性、ATP竞争性CaMKⅡ抑制剂。Lebek 等[36]测试了GS-680的抗心律失常和变力作用，结果表明，GS-680对CaMKⅡδC有良好的选择性，可显著降低离体的人心房肌细胞的早期和延迟的去极化作用，并可通过减少SR Ca2+-泄漏来抑制过早的心房收缩，在人右心房肌小梁中起抗心律失常作用；同时，GS-680还减弱了心室肌小梁的负力-频率关系，并增加了终末期HF患者心室肌细胞的钙瞬态振幅；此外，在实验测试浓度下，GS-680将占据基本上所有可用的CaMKⅡ ATP结合口袋，预计GS-680会抑制所有形式的活化CaMKⅡ。以上结果表明，GS-680可抑制人体心房的心律失常活动，并改善HF的心室收缩力，且GS-680化合物有高选择性和良好的生物利用度，具有成为临床用药的巨大潜力。

RA306是一种新型、高选择性、强效的ATP竞争性CaMKⅡ抑制剂，是Beauverger等[37]重新搭建吡啶并嘧啶系列ATP竞争性CaMKⅡ抑制剂后启动内部化学优化程序得到的化合物，他们将RA306用于携带α-肌动蛋白基因突变(这种基因突变会导致人类扩张型心肌病)的患病小鼠，并口服给药，结果显示，RA306组心脏苏氨酸-17位点上PLB的磷酸化均受到抑制，且CaMKⅡ活性降低，而超声心动图结果显示，与对照组相比，RA306组小鼠的心脏功能(射血分数和心排血量)均显著改善；此外，RA306的化学优化目标包括：改善CaMKⅡδ在纳摩尔范围内的效价，通过提高激酶选择性避免脱靶的不良反应，实现低脑渗透(<10倍心脏暴露)以避免中枢神经系统不良反应，提高口服生物利用度并持续抑制心肌中的CaMKⅡ(>12 h)等。以上实验结果均支持RA306这种新型口服CaMKII抑制剂的临床可行性，有益于HF的治疗。

4.3其他抑制剂 有试验使用新型抗糖尿病药物恩格列净(钠依赖性葡萄糖转运蛋白2的选择性抑制剂)治疗有心血管疾病的糖尿病患者，结果显示心血管死亡的发生率降低了38%(n=7 020)；同时，对潜在的机制进行了讨论，发现这种有益效果不是由于缺血性终点(脑卒中或心肌梗死)的减少，而是由于HF住院风险降低所致[38]。此外，恩格列净通过调节缺血危险因素(血压、低密度脂蛋白胆固醇、糖化血红蛋白)，也能发挥有益于心血管的作用。通过对上述试验进行分析发现，血细胞比容和血红蛋白的变化是对心血管死亡风险影响最大的变量，而不是糖化血红蛋白的变化，表明血糖控制并不是主要的心脏保护机制[39-41]。Mustroph等[42]测试了恩格列净治疗后人和小鼠心室肌细胞中CaMKⅡ活性和Ca2+的变化，他们将主动脉缩窄术后的HF野生小鼠和人类衰竭的心室肌细胞暴露于恩格列净中，24 h后小鼠心室肌细胞CaMKⅡ活性以及CaMKⅡ依赖性RyR磷酸化水平均降低，在人类衰竭的心室肌细胞中也具有相似的结果；且HF野生小鼠和人类衰竭的心室肌细胞中，恩格列净降低了Ca2+火花频率，增加了SR Ca2+负荷和Ca2+瞬时振幅，即减少了Ca2+-泄漏，改善了心肌收缩力。虽然恩格列净降低CaMKⅡ活性的具体机制目前尚不清楚，但恩格列净可以用于治疗HF等CaMKⅡ活性增加的疾病，这一发现或可为HF合并糖尿病的治疗提供新方向。

Rem2是一种活性调节基因，主要在脑中表达，同时脑中也存在所有4种CaMKⅡ同工酶。Rem2是单体G蛋白的Ras超家族的RGK亚家族(Rem2、Rad、Rem和Gem/Kir)的成员，相对于其他Ras家族成员，Rem2含有延伸的N端和C端[43]。Rem2可直接与CaMKⅡ相互作用并有效抑制完整全酶的活性，它允许CaMKⅡ自磷酸化，但阻止CaMKⅡ对其他靶点的磷酸化作用，这是一种前所未知的Rem2功能[44]。虽然Rem2是体外CaMKⅡ的底物[45]，但Royer等[44]证实了Rem2与CaMKⅡ可以在体内结合，并检测了CaMKⅡ-Rem2相互作用的能力，发现两者的互相作用较激酶和底物之间更稳定。该研究结果表明，Rem2的抑制作用涉及与CaMKⅡ中枢结构域和底物识别结构域的相互作用。此外，Royer等[44]还发现，Rem2 N端(Arg-79和Arg-80)中两个关键氨基酸残基被取代后其抑制CaMKⅡ的能力完全消失。这些研究结果将有助于进一步研究Rem2抑制细胞中CaMKⅡ的机制，进一步推动内源性CaMKⅡ抑制剂的研究。

5 小 结

尽管AS105等小分子抑制剂克服了使用KN93的许多局限性，为推进CaMKⅡ抑制剂的研究提供了帮助(包括脱靶效应、低效价以及仅阻止非磷酸化CaMKⅡ等)，但AS105等小分子抑制剂应用于临床尚需时间。在临床应用(尤其是长期应用)CaMKⅡ抑制剂时，除了细胞渗透的问题外，如何减轻CaMKⅡ抑制剂对脑中CaMKⅡα、β亚型的作用至关重要，这可以防止对记忆和神经元可塑性的有害影响。因此，还需要进一步探索方便临床应用的抑制剂、载体技术和传递技术，使高效、安全、长期地抑制CaMKⅡ活性成为可能。