3D打印复合支架修复软骨缺损的研究进展

凌昊楠，李松军

(遵义医科大学第五附属(珠海)医院骨一科，广东 珠海 519100)

关节软骨在多种情况下均会受到损伤，如关节软骨病、骨性关节炎以及创伤等，给患者带来痛苦和不便[1]。由于关节软骨缺乏营养供应，损伤后几乎无法自我修复，而传统的治疗方法(如微骨折术、软骨下钻孔术)修复的是纤维软骨，与周围正常软骨不同，因此疗效不佳[2]。目前，越来越多的研究认为，软骨下骨在修复软骨缺损中起重要作用，软骨修复观念从单纯的软骨修复转变为骨软骨一体化修复[3]。近年来医疗技术发展迅速，组织工程技术使用“支架+种子细胞+细胞因子”作为新型的治疗理念更是得到了广大医学工作者的认同[4]。而支架又是组织工程的重中之重，以往的支架制作方法(如气体发泡、溶剂浇筑、熔化铸造[5])因难以制备多种结构特异的个性化支架而在实际应用中受到了较大限制，随着3D打印技术的出现，一种与传统材料加工方法完全不同的制造方式出现，其可以精确控制支架的尺寸和特性[6]，并能最大限度符合个体的需求。同时，在支架材料选择方面，目前的单一材料在不同方面均存在一定弊端，很难满足理想支架的属性，因此越来越多的研究将不同材料混合打印复合支架，尽可能地满足理想的支架属性[7]。现就3D打印复合支架修复软骨缺损的研究进展予以综述。

1 理想支架的属性

1.1可降解性及孔隙设计 一般而言，理想的组织工程支架由可生物降解的材料组成，且具备高孔隙率，高孔隙率的设计使细胞易于附着、增殖和分化，同时可提高细胞活力，使其更易在支架内生长[8]。在缺乏血液营养的情况下，相互连接的孔隙结构可促进氧气向组织内部扩散并提供营养物质，且有助于代谢废物排出；多孔隙性还可支持细胞向支架内迁移生长，增加细胞与支架附着和相互作用的最大表面积，为细胞生长提供良好的环境[9]。可定制孔隙的大小也是理想支架的特点之一，已有研究证明，支架的孔隙密度和尺寸大小对细胞的生长和黏附具有重要意义[10]。孔隙尺寸减小，支架的整体有效表面积将增加，这会使支架本身的可用性增加，但需注意的是，过小的孔径可能很难使细胞黏附在支架上[11]。因此，需要精确的孔隙设计使细胞更好地黏附并生长于支架上，形成支架复合物，最后随着支架材料由外到内逐渐收缩降解，促进宿主细胞作用于组织缺损处而发挥作用。

1.2生物相容性 由于组织工程支架制备有细胞参与，并需要在植入活体内发生作用，因此制作支架的材料不得含有任何导致细胞坏死或凋亡的细胞毒性元素，且容易从体内排出，其引起的免疫反应也应尽可能达到可忽略[12]。常见的细胞毒性来源包括构建支架的大分子、光聚合所用的引发剂、聚合物合成中的有机溶剂残留以及聚合物降解产物等，选择打印材料时必须考虑这些因素。目前有很多方法(如表面改性、碱化处理、表面血清涂层)可提高打印材料的生物相容性[13]。Hosseini等[14]设计并改进了一种新型纤维支架的制作方法，利用聚乙醇酸作为原材料制作3D支架，并使用聚4-羟基丁酸进行表面涂层改性，制作成功后与细胞共培养进行体外实验，结果显示，沿着聚乙醇酸纤维方向的细胞排列增加。

1.3生长因子 生长因子也是理想的组织工程支架中必不可少的一部分。特定的生长因子和生物分子可以调节新生软骨的形成和细胞外基质的沉积。如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在骨和软骨的发育中起关键作用，具有诱导始祖细胞分化的能力[15]。同时，生长因子的不同使用剂量对于骨组织的形成发育也有一定的影响作用，选取最适宜剂量的生长因子可以更精准地促进干细胞向特定方向增殖分化。要想充分发挥生长因子的治疗潜力，生长因子的载体选择尤为重要，载体设计必须满足一些特定要求(如提供局部递送和模拟动态的天然生长因子表达水平)和模式[16]。目前已有血管内皮生长因子、转化生长因子-β1、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子-1和成纤维细胞生长因子等生长因子搭配不同载体在骨及软骨组织工程中成功应用的实例[17]。Cipitria等[18]将定量的BMP负载医用聚己内酯磷酸钙支架置入绵羊胫骨30 mm缺损处，而对照组则单纯置入聚己内酯磷酸钙支架，术后12个月观察两组缺损处的新生组织，结果发现，搭载BMP组的骨缺损修复效果更显著，证实BMP可促进新生骨组织的形成。

1.4机械性能 良好的机械性能可提供细胞支撑作用并保持结构稳定性，并为促进细胞分化提供良好的环境，是影响骨及软骨组织生长的关键。支架置入后，可在缺损部位组织修复前暂时起到替代作用，以达到理想的细胞分化结果，这就要求具有较高的力学性能，因此选择与天然骨及软骨组织相似硬度的支架材料会更加有利[19]。3D打印技术具备可调控支架微观结构的优势，因此可制备出刚度与目标组织相匹配的个性化支架，符合理想支架的制备要求。Bahcecioglu等[20]以聚L-乳酸/聚乳酸-乙醇酸为复合材料制作3D打印支架，并研究支架微结构与力学性能对纤维软骨细胞和成纤维细胞附着、扩散和增殖等的影响，结果显示，3D微孔支架上的细胞行为主要受孔径和支撑刚度的调节，细胞的响应取决于细胞和材料的刚度，证明了机械性能对理想支架的重要性，有助于设计更理想的组织工程支架。

2 3D打印技术原理分类

3D打印技术又被称为快速成型技术，是当前各行各业研究的热点，其基本原理是“分层构建，逐层叠加”[21]，可以在计算机3D模型的数据基础上快速精准地构建复杂外观与内部微观结构，并逐层打印出实体模型，以最大限度地满足个性化需求。

2.1光固化立体印刷(stereolithography，SLA) SLA简称光造型术，是目前运用最广泛的3D打印技术。SLA常用的材料为光敏树脂，包括高光敏性的高分子材料(聚乳酸、脂肪族聚酯等人工合成的高分子以及蛋白质、多糖等天然高分子)，液体的光敏聚合物经紫外激光照射扫描的定向作用逐渐聚合固化，从而达到定点固化光敏聚合物建模的目的[22]。虽然SLA可以快速生产具有受控结构和微米级分辨率的支架，但支架成型后需要清洗杂质，可能影响原形状，对制作材料的限制较多，实际运用中的成本较高[23]。Luo等[24]利用SLA技术以聚富马酸丙烯酯为原材料制作3D支架，并研究其物理化学参数(包裹黏度、聚合物浓度、聚合度和树脂打印温度等)对支架力学性能的影响，最终证实3D打印聚富马酸丙烯酯支架具备良好的力学性能，可以作为骨及软骨组织工程中的备用支架。

2.2选择性激光烧结(selective laser sintering，SLS) SLS使用受计算机控制的红外激光束将粉末状的材料高温熔融后实现黏结固化，再逐层烧结形成所需的支架。SLS加工速度快，可创造出机械性能高的精细结构支架，但其成型产品表面粗糙，处理过程中易产生粉尘、毒气等有害气体，且高温易引起高分子材料降解或变性，限制了细胞和其他生物材料与支架的复合[25]。Saska等[26]运用SLS技术以聚3-羟基丁酸酯为材料制作3D支架，并研究了聚3-羟基丁酸酯支架的外形、孔隙率、热性能以及力学性能，结果显示，SLS技术使聚3-羟基丁酸酯支架的烧结具有层次结构，孔隙相互连通，孔隙率为(55.8±0.7)%，孔径为500～700 μm，力学性能良好，可以作为优秀的组织工程支架。

2.33D生物打印技术 传统的组织工程技术首先进行干细胞的分离培养，将其增殖传代后接种到预制支架上，然后在支架上培养细胞使其黏附生长形成支架复合物，再结合不同的生长因子诱使干细胞向不同组织、不同功能的细胞分化，以达到构建特定组织的目的[27]。但此方法无法使干细胞等生物成分均匀分布，存在无法完全仿生正常组织等弊端，很难构建复杂的分层组织结构。3D生物打印技术作为一种新兴技术，利用活体细胞、细胞外基质和液态生物材料等形成的混合“生物墨水”直接打印材料-细胞一体化支架，以构建复杂的内部组织结构，但3D生物打印技术对打印材料“生物墨水”的要求较高，需要具备匹配的打印速度、高分辨率、适宜的细胞浓度以及“墨水”液滴体积[28]。“生物墨水”也是目前热门的研究方向，Zhang等[29]使用3D喷墨生物打印技术以含丙烯酰化肽的聚乙二醇水凝胶和间充质干细胞为“生物墨水”成功打印出生物支架，并证明了支架与细胞具有良好的生物相容性，可作为理想的组织工程备用支架。

3 3D打印复合支架材料及其应用

3D打印支架的理想材料对于力学强度、降解产物的性质有较高要求，目前常用的打印材料主要包括天然高分子聚合物、人工合成高分子材料以及生物陶瓷三大类[30]。由于单一材料具有机械强度不足、存在致病性杂质以及降解产物不利于骨细胞成长分化等弊端，因此研究人员尝试将两种以上材料混合形成复合材料，打印组织工程复合支架。

3.1以胶原蛋白为基础材料的复合支架 在组织工程使用的天然聚合物材料中，胶原蛋白是最常用的一种打印材料，已知的胶原蛋白约有29种类型，Ⅰ型胶原蛋白作为正常细胞外基质的一部分，因具有较好的细胞亲和力、免疫反应少、可生物降解、刺激细胞增殖分化等优势，在骨及软骨组织工程中应用广泛[31]。由于胶原蛋白不具备足够的机械强度[32]，因此常结合其他材料打印复合支架。已有研究人员将Ⅰ型胶原蛋白作为基础材料加入其他材料形成混合材料成功打印出复合支架，如Grigolo等[33]首先使用Ⅰ型胶原蛋白与羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)混合作为打印材料制作出用于修复软骨损伤的复合支架，随后将人骨髓间充质干细胞接种于该复合支架上进行黏附培养，最终形成支架复合物，体外实验免疫组织化学染色证实，骨髓间充质干细胞可以分化为软骨细胞。Duarte Campos等[34]研究发现，Ⅰ型胶原蛋白与琼脂糖混合后的复合材料可作为优秀的3D生物打印油墨基质，在结合细胞后可利用生物打印技术打印出适用于软骨及软骨下骨修复再生的复合支架。

3.2以聚乳酸为基础材料的复合支架 聚乳酸是一种常用的热塑性高分子材料，具有良好的生物相容性、化学稳定性、可降解性和可吸收性，目前已被广泛用于制造螺钉、血管移植物等医疗器械[35]。但聚乳酸不具备细胞外基质良好的细胞亲和性，细胞黏附性差[36]，因此在组织工程应用中需进行一定处理改性或与其他材料结合成为复合材料以“取长补短”。王云起等[37]研究表明，经氢氧化钠处理的聚乳酸表面粗糙度由2 nm增加至40 nm，支架表面空隙增多，可显著提高细胞的黏附性。Yang等[38]运用含聚乳酸、聚己内酯以及疏水性修饰的二氧化硅纳米粒子混合后进行3D打印制作出孔隙率超过98%的复合支架，并在后续的实验中验证了高孔隙率的支架结构支持骨髓间充质干细胞的黏附和增殖，显示了良好的生物相容性。

3.3以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)为基础材料的复合支架 PLGA属于人工合成高分子聚合物，是当前组织工程支架的热门研究材料，具有降解率可控、孔隙率较高和毒性反应低等优点，并可以根据患者情况进行个性化定制[39]。但PLGA的非晶体结构具有较低的杨氏模量，对弹性变形不敏感，机械性能较差，因此常与其他材料混合制作复合支架。Yang等[40]使用PLGA和HA作为混合材料进行3D打印制作出多孔PLGA-HA复合支架，体外实验证明，其抗压强度较单纯PLGA支架显著增加，具有良好的机械性能，同时PLGA-HA复合支架较单纯PLGA支架更有利于细胞附着、增殖、扩散和成软骨分化，是优秀的组织工程备用支架。Lai等[41]利用镁粉、PLGA和β-磷酸三钙混合后作为打印材料，用3D低温快速成型技术打印PLGA/β-磷酸三钙/镁复合支架，并将其置入实验动物体内，证实了PLGA/β-磷酸三钙/镁复合支架具有良好的仿生结构和力学性能，同时该复合支架对软骨生成及血管新生有一定的促进作用，具有巨大的临床应用潜力。

3.4以HA为基础材料的复合支架 HA属于生物陶瓷的一种，具有优秀的生物相容性和生物活性，且骨传导性能强，常作为软骨修复中软骨下骨修复的支架材料。但HA刚性不足和降解速率较慢限制了其在组织工程中的应用，因而常将HA与其他材料混合制作复合支架。Yu等[42]将1,6-己二醇-L-苯丙氨酸基聚与HA纳米晶混合，通过3D打印制作出孔隙率75%的复合支架，并在体外接种MC3T3-E1成骨细胞，进行体外实验培养后最终证明1,6-己二醇-L-苯丙氨酸基聚/HA复合支架可成功诱导成骨细胞的增殖和分化，具有巨大的应用潜力。Yao等[43]利用聚己内酯与HA混合的复合材料通过3D打印成功制作出了力学性能强、可塑性高、生物可降解性良好的复合支架，该复合支架可作为软骨修复的理想支架。

4 小 结

3D打印技术可以根据受损部位的三维结构，设计出个性化的组织工程支架，同时不同材料的复合使用可以打印出性能更加优异的理想支架。随着不同材料复合使用研究的深入，结合组织工程技术，越来越多的组织工程复合支架被用于软骨缺损修复的研究，显示了其在软骨缺损修复方面的巨大潜力。但复合支架的实际临床运用仍面临巨大挑战，如支架的即时打印固化成型、制备过程耗时较长、实际使用时的无菌保存以及固定方式等均需进一步研究。另外，目前尚无临床3D打印技术应用的相关政策法律及规章，且有关伦理、材料安全等问题尚未解决。