动物肝硬化模型构建的研究进展

李松，倪德生

(金华市人民医院肝胆外科，浙江 金华 321000)

肝硬化是肝脏病变的最终结果，其病理变化主要表现为肝细胞的广泛坏死，残存肝细胞结节性再生，结缔组织增生，形成纤维隔，破坏肝小叶结构，导致假小叶形成，肝脏组织发生变形变硬，最终成为肝硬化。在我国，肝硬化形成较为常见的因素主要是由乙型肝炎病毒(HBV) 和丙型肝炎病毒(HCV)感染导致的[1-2],一般情况下，肝硬化代偿期属于 Child-Pugh A级，由于肝脏代偿功能较强可无明显症状，也可有轻度乏力、腹胀、肝脾轻度肿大、轻度黄疸、肝掌、蜘蛛痣的表现，而肝硬化失代偿期则属于Child-Pugh B C级，以不同程度的肝损害和(或)门静脉高压为主要表现，并伴有多系统受累，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病(HE) 继发感染脾功能亢进、腹水、癌变等并发症，严重影响人类健康。目前对于肝硬化的治疗包括病因治疗、门静脉高压及食管胃静脉曲张(esophageal gastric varices，EGV) 出血的治疗、腹水的治疗、功能性肾衰竭的治疗、感染的治疗、肝性脑病的治疗。对于失代偿期肝硬化，内科常规的保肝和对症治疗不能延长患者生存期，原位肝移植是唯一有效的治疗手段，但受供肝缺乏、费用高昂等因素的限制，须严格评估肝硬化患者的适应证和禁忌证。所以提倡早发现、早预防、早治疗，防止疾病进展对于肝硬化患者尤为重要，这样可以减少肝硬化患者临床失代偿性并发症的体现。但目前来说比较艰难的问题还是终末期肝硬化患者，因此寻找有效的方法治疗肝硬化十分紧迫。实验性肝硬化模型的建立始于1938年，以往的多以鼠为主，用以药敏实验居多，不适宜手术的干预[3-5]。而大型动物肝硬化的制备又非常困难，因此，建立合适肝硬化模型，能为后续的手术干预创造有利条件，本文就动物肝硬化模型研究进展做一简要综述。

1 肝硬化模型

1.1 化学性肝硬化模型

1.1.1 二甲基亚硝胺(DMNA)诱导肝硬化模型 二甲基亚硝胺主要是由肝内氧化酶作用下进行氧化代谢激活，例如N-脱羟基生成甲醛物质，或者产生活性甲基和酚酞烷基亚硝胺。再经过氧化形成甲烷亚硝胺，这些物质对肝脏形成一定的危害，可以导致肝细胞坏死，纤维组织形成，肝脏萎缩，蛋白合成能力下降，肝功能失代偿，进一步形成肝硬化。该模型较稳定，与肝炎形成的肝硬化较相似。研究[6-8]显示用0.5% DMNA溶液2 mL·kg-1(盐水稀释)腹腔注射小鼠，每天1次，4周便形成肝硬化，成模率较高，时间较短。有研究者使用上述方法建模[9-13]，发现二甲基亚硝胺不是导致肝脏纤维结缔组织沉积而形成肝硬化，而是导致肝脏实质细胞大面积坏死，破坏并改变了肝窦壁的结构，肝脏萎缩，肝功能损害而形成肝纤维化，最终形成肝硬化。DMNA制造肝硬化模型具有以下特点，成功率高、动物死亡率低，而且稳定性较好。由于其过程易形成肝硬化门脉高压，所以该方法常用于肝硬化门静脉高压类动物模型的研究[14-17]。该建模方法是用来研究肝硬化过程中病理生理变化产生的一些组织学变化指标。随着对该疾病发病机制以及药物疗效的深入研究， DMNA出现一定的弊端，其价格较贵、剂量难以掌握，毒性大易挥发，容易影响周围的环境和人，再加上用大动物作为研究对象，价格昂贵、管理困难，所以近来运用此种方法制备大动物肝硬化模型较为少见。但考虑DMNA制备肝硬化模型的一些优点，国内外尚有应用DMNA制备大鼠肝硬化模型用于肝硬化机制及筛选抗纤维化药物的研究报道。

1.1.2 CCl4是由甲烷和氯气作用产生的一种无色透明的液体，是常用的肝硬化诱导物质，对肝细胞有很强的毒性作用。其作用是溶解肝细胞膜，经肝细胞内质网的细胞色素P450依赖性混合功能氧化酶的代谢作用下释放三氯化碳(-CCl3)，进一步经过氧化作用，破坏肝细胞膜、影响蛋白质合成，肝功能损害，肝硬化形成。CCl4建模的原理是其作用于肝脏，导致肝细胞损害的过程中会产生一些炎症因子和自由基，进一步激活肝星状细胞(HSC)，产生过多的细胞外基质沉积于肝内导致肝脏纤维化，进一步发展为肝硬化。人类药物性肝硬化病理特点与其有很多相似之处[18-20]，再加上CCl4诱导动物模型具有以下优点，操作简便、材料价廉，以及病变典型，所以很多研究者选用该建模方法研究药物性肝硬化发病机理[21-22]，评估抗肝硬化药物的药效。当前的制作肝硬化模型的方法包括，单纯 CCl4建模、CCl4联合苯巴比妥、CCl4联合乙醇、CCl4复合法等。虽然该方法成模率低、死亡率高，但由于其一定的优点，很多肝硬化相关动物实验研究还是采用该建模方法。

1.2 酒精性肝硬化模型 酒精主要在肝脏内代谢，代谢过程中会产生许多毒性物质。酒精抑制肝细胞的能量代谢循环，导致脂肪酸合成增加，发生脂肪变，进一步造成肝脏形态和功能的改变，再加上酒精的直接毒害作用，如损伤血管内皮细胞、激活储脂肪细胞，导致肝细胞的结构和功能损害，进一步导致肝纤维化及肝硬化[23-25]。近年来，随着国民经济的飞速发展，居民生活水平提高，酒精性肝硬化的患者逐渐增多，对人类健康构成了一定的威胁。长期过度饮酒可以导致肝硬化。有研究者利用狒狒作为研究对象，成功的制作了酒精性肝硬化模型。该动物与人类结构较相似，所以酒精性肝硬化的发生机制、病理生理改变以及药物治疗多用此模型进行研究，但是狒狒价格较贵，而且不易获得。Lee等[26]采用长白猪作为研究对象，维持12个月制备肝纤维化模型，时间较长，可见如何缩短造模时间提高造模成功率是此模型今后研究的重点。由于制造模型的时间较长，实验周期长、造模不稳定，所以这种造模方法多用于酒精造成肝损害机制的研究。

1.3 手术性肝硬化模型 该模型的原理是引起胆管梗阻。具体操作是通过结扎胆总管，使胆汁排除困难，造成肝内胆汁淤积，进一步引起毛细胆管梗阻，汇管区胆管扩张，肝脏纤维组织增生，最终形成肝硬化。有研究者[27-28]利用鼠作为研究对象，手术解剖胆总管予以结扎。该方法一般需要6周，缺点就是死亡率较高，达到30%以上。基于鼠生理结构的特点，此模型应用的比较多，由于鼠缺乏胆囊，所以并发症的概率较大，因此死亡可能性也增加。胆管结扎后再通，使组织学形成了逆转。由于此模型血流动力学变化比较突出，所以该模型制造方法常用于研究门静脉高压症血流动力学的改变。

1.4 免疫性肝硬化模型 导致肝细胞损伤的各种因素(化学药物、酒精、病毒)作用于肝脏，在产生肝细胞损害的过程中，由于物质结合后可获得抗原性，进一步破坏了机体免疫耐受机制，经过机体免疫产生自身抗体，进一步引发一系列的病理变化，造成肝细胞凋亡，最终形成肝硬化。比如病毒性肝炎，是我国目前最常见的肝硬化病因。由于鼠不易被人类嗜肝细胞病毒感染，用传统方法造模无法成功，不少研究者近年来开始用尝试新的技术[29-31]，利用转基因技术建立此种模型，如肝炎病毒转基因模型、人类肝嵌合模型是比较常用的方法。由于小鼠的免疫机制对病毒抗原耐受，并不产生损伤肝细胞的沉积物，所以无法观察到宿主的免疫应答形成机理[32-33]。目前该造模方法用于病毒复制、基因表达等研究。人类肝嵌合模型使小鼠体内高表达尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)，从而激活降纤作用破坏肝细胞。但此种模型免疫缺陷，无法观察到免疫应答过程。但由于此模型能感染肝炎病毒，所以此方法常用来抗病毒药物药效的评估。

1.5 其他性肝硬化模型 血吸虫虫卵在肝脏内沉积，导致肝内肉芽肿炎症及免疫反应，形成可溶性虫卵抗原，进一步造成肝星状细胞凋亡，同时激活大量的成纤维细胞，形成大量的胶原纤维，最终形成肝硬化。有研究者注射日本血吸虫，在第6、8、10周分别形成不同的变化，在汇管区有大量虫卵，炎症细胞刺激形成肉芽肿，虫卵周围沉积了大量纤维细胞，纤维组织增生；进一步导致肝小叶间胶原纤维沉积，肝小叶结构被破坏导致假小叶形成[34-36]。所以抗血吸虫的药物实验和门静脉高压症的研究常用此模型。

2 模型动物选择

2.1 小型动物 对于不同的研究目的，小型动物的选择性较高，目前最常用的小型动物是小鼠。对于肝硬化模型以及其他相关研究来说，小鼠作为研究对象建模具有大量化、多样化、成熟化的特点[37-38]。但小鼠的体积较小也有一定的弊端，由于血样本较少，不能同时完善多项指标测定，对于外科微创手术的操作更不适合。目前最重要的是，由于小鼠与人的解剖结构相差甚远，所以一些疾病发展过程的生理、生化正常值也不尽相同。如果想对小鼠肝硬化模型以及肝硬化引起的门静脉高压症的手术方式进行研究，操作十分不方便，而且小动物模型很难达到预期的效果。

2.2 中型动物 对于外科微创手术介入的研究，小型动物由于体形小的原因，受到很大的限制，尤其是肝脏血管的外科实验，小型动物建立的手术阻断肝硬化模型应用就有很大困难。相对于大来说，中等体形动物模型更合适(比如大白兔)。有研究者使用兔作为研究，不但简便、经济，而且成功率很高[39-40]，特别对肝性脑病的磁共振波谱、动物肝移植的实验研究更适用。

2.3 大型动物 利用大动物(猴子、猪、犬等)建立模型，用于观察外科治疗疗效相当重要。有研究者利用大型动物建模，制作门静脉高压模型[41-42]。因为其饲养简单容易采集样本，观察多项指标方便，而且大型动物肝脏大小适中，取材方便。有研究者用猪作为研究对象，建立猪肝硬化模型。因为猪的结构接近人类，而且对实验耐受性强、解剖结构清晰、操作方便。也有研究者使用犬运用改良四氯化碳皮下注射法制备犬肝硬化门静脉高压症模型，而猴子由于价格比较贵，较少用于动物实验研究。

利用动物建模需要合适的方法。因为动物实验与体外细胞培养不同，动物的解剖特点可以更好地帮助我们研究肝硬化的生物医学和病理组织学特征[43-44]，帮助我们在复杂的体内多器官系统中观察各项指标，为开展新的治疗措施和测试新的治疗药物提供条件。近期采用不同剂量、不同频度的CCl4做皮下注射新西兰大白兔来研究合适浓度四氯化碳建模效果，虽然取得了一定的研究结果，由于动物和人类毕竟存在差异，其发病机制不同于人类，所以实验中的一些新的发现尚不能直接应用于临床。

综上所述，由于动物结构与人类种属差异，现在没有出现合适的动物肝硬化模型能够很好地展现出人的肝硬化特征。但是我们不可否定的是，动物模型给研究者带来一定益处，它们帮助我们更好地研究疾病发病机制，寻找出新的治疗策略。随着研究的进展，有望寻找一种合适的动物建立有效的动物模型，更好地研究肝硬化发病机制，寻找出肝硬化治疗有效药物，为更好地外科干预提高更好的条件。