靶向性超顺磁性氧化铁纳米颗粒早期诊断胰腺癌的研究进展

谭广，李卉

(上海交通大学附属第六人民医院放射科，上海 200233)

胰腺癌起病隐匿，且具有高侵袭性，在早期无症状时即可呈浸润性生长，其年死亡率与发病率相当，5年生存率仅为5%[1-2]。虽然放化疗可改善胰腺癌患者5年生存率，但治疗效果有限，在杀伤胰腺癌的同时，也会产生不良反应，化疗药物耐药性的产生也较明显[3]。目前胰腺癌治疗仍首选手术治疗，术后患者5年生存率提高[4]。但大多数患者诊断胰腺癌时已失去手术指征，预后往往较差。鉴于胰腺癌早期转移的特性以及目前治疗手段的局限性，实现胰腺癌的早期诊断对疾病的治疗及预后至关重要。临床工作中，磁共振成像的应用已较为普遍，其图像解剖分辨率高，结合磁共振造影剂，可大幅度提高组织间对比度。其中，超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)进入体内后能够缩短横向弛豫时间(T2值)，使强化的组织在T2加权图像上表现为低信号[5]。近年来，研究人员通过基因组学、蛋白质组学等方法发现，胰腺癌具有一系列特异性高表达分子，可作为胰腺癌的生物学靶标[6]。SPIO生物兼容性、生物可降解性好，生物毒性低[7]，且SPIO具有丰富的表面活性基团，易于对其进行表面化学修饰，若在SPIO表面连接相应配体，便可主动靶向于肿瘤部位，实现胰腺癌的靶向性诊断。现就主动靶向性SPIO用于胰腺癌早期诊断的研究进展予以综述。

1 制备方法

SPIO的制备方法有多种，主要包括化学共沉淀法、高温热解法、水热法、微乳液法等[8]。直接合成的SPIO由于磁性吸引和范德华力容易沉淀聚集，易被人体内的网状内皮系统吞噬[9]，故需要对SPIO进行表面修饰以提高其稳定性和分散性。聚乙二醇是最常用的表面修饰剂，能够提高SPIO的稳定性及水溶性，减少与血浆蛋白的交联，从而减少网状内皮系统单核/巨噬细胞对SPIO的摄取，延长其在体内的循环时间[10]；且可以通过聚乙二醇连接其他基团(如-NH2、-COOH、-CHO、-OH及-SH)进行更多的表面化学修饰，从而延伸出一系列具有特定功能的造影剂，具有广阔的应用前景。这也是SPIO实现生物利用和主动靶向的基础。旋糖苷是另一种较常见的表面修饰剂[11]。

化学共沉淀法合成的SPIO较易发生团聚，分散性和结晶度相对较差，样品杂质含量也较多，但由于操作步骤相对简单，对实验条件要求不高，成本也相对较低，故目前仍是SPIO最常用的制备方法。其他3种方法可以制备出分散性和结晶度较好的SPIO，但生产成本或设备要求较高。因此，以上4种SPIO的合成方法各有利弊，在实际应用中应根据需要及技术条件等综合考虑。

2 原 理

氧化铁是磁性纳米材料中最主要的组成部分，主要包括Fe3O4和Fe2O3[12]。由于铁原子不成对的核外电子高速旋转产生净磁化向量，因此具有很强的顺磁性。磁性颗粒在室温下具有磁记忆，但因SPIO直径在纳米级范围内，故其失去了磁记忆而成为超顺磁性物质[13]；在组织中，由于强磁矩的作用，SPIO周围磁场的均匀性发生了改变，当水分子弥散穿过不均匀磁场时造成自旋失相位和横向弛豫加速，缩短了T2时间[14]。SPIO的影响效应在T2加权成像图像上表现为低信号，因此SPIO也被称为阴性对比剂。

3 主动靶向性SPIO的优势

被动靶向，即高通透性和滞留效应，主要由于肿瘤组织的脉管系统破损，渗漏增加且缺少有效的淋巴回流，因此纳米颗粒能够经过血流被动富集于肿瘤部位，相较于正常组织，肿瘤部位纳米颗粒浓度升高。而连有靶向配体的纳米颗粒，借助配体与靶细胞表面过表达受体之间的高度亲和力，选择性地输送至特定部位，从而实现主动靶向。与被动靶向相比，主动靶向通过纳米颗粒的特异靶向性，可以进一步提高特定部位的纳米颗粒浓度，并减少其在非肿瘤部位的蓄积以及降低对正常组织的伤害，从而增加肿瘤部位与其他部位的成像对比度，有利于疾病的诊断，具有明显优势。基于不同生物学靶标，靶向配体可为单克隆抗体、抗体片段、重组蛋白及多肽等。文献报道，SPIO结合特异性靶向配体，可以实现胰腺癌的早期诊断，有利于疾病的及时干预[15]。

4 胰腺癌靶向性SPIO

目前，用于胰腺癌最常用的血清肿瘤标志物为糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)，但并不是所有胰腺癌患者均高表达CA19-9，其他胃肠道癌症患者中也可异常高表达CA19-9，因此CA19-9诊断胰腺癌的敏感性和特异性欠佳。此外，CA19-9也不能提供原发灶或转移灶病变部位的相关信息[16]。可见，用于胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物，应在肿瘤部位异常高表达，而在正常或其他病变组织内低表达甚至不表达，并具有一定的敏感性和特异性。

4.1尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)及其受体(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR) uPA是一种丝氨酸蛋白酶，与uPAR相互作用后可参与调节肿瘤基质的降解、癌细胞的侵袭、转移以及血管生成等多种肿瘤行为[17]。可见，uPA与uPAR相互作用可增加肿瘤的恶性程度，若采用uPA类似物竞争结合uPAR，也许可以改善肿瘤患者预后。研究表明，在超过86%的胰腺癌组织中，肿瘤实质细胞及肿瘤间质中的成纤维细胞和巨噬细胞均异常高表达uPAR，而uPAR在正常胰腺及慢性胰腺炎组织中几乎不表达[18]。因此，uPAR能作为胰腺癌诊断或治疗相关研究中较好的细胞表面受体。

胰腺癌是乏血供肿瘤，间质成分相对较多。研究表明，肿瘤间质的形成与胰腺癌的增殖、侵袭、转移以及化疗耐药性的产生有很大关系[19-20]，这也是胰腺癌恶性程度高的另一个原因。同时，肿瘤间质较多也限制了化疗药物有效进入肿瘤细胞内[21]。鉴于此特点，Yang等[22]在氧化铁纳米颗粒(iron oxide nanoparticle，IONP)表面连接uPAR特异性结合配体的N端片段(N-terminal fragment，ATF)和近红外荧光分子Cy5.5构建Cy5.5-ATF-IONP发现，其可以有效实现对胰腺癌主动靶向的磁共振与荧光双模态成像，对小鼠原位胰腺癌甚至是转移灶均能很好地显影。另有研究在SPIO表面连接uPAR特异性结合配体ATF，并通过溶酶体底物肽链连接化疗药物吉西他滨(gemcitabine，Gem)构建了ATF-IONP-Gem[23]。结果显示，在ATF的主动靶向及受体介导的细胞内吞作用下，ATF-IONP-Gem进入肿瘤细胞内，在细胞内溶酶体的酶切作用下，底物肽链被切断，Gem释放出来，从而可以有效抑制肿瘤的生长，且IONP作为造影剂，可以进行磁共振显像，实现胰腺癌的主动靶向成像和精准治疗。因此，uPAR能够作为胰腺癌较好的靶点，在某种程度上可能减轻胰腺癌乏血供引起的探针灌注不足。

4.2胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)及其受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) IGF1R是一种跨膜的酪氨酸激酶活性受体，结构与胰岛素类似，可被IGF1启动[24]。IGF1R与配体结合，可启动自磷酸化和一系列下游级联信号转导，继而促进细胞生长。研究表明，IGF1R在多种肿瘤中高表达，并可能通过促进细胞增殖及抑制细胞凋亡等方式促进肿瘤的发生与进展[25]。

与uPAR类似，IGF1R在40%～90%的胰腺癌及其肿瘤基质中高表达[26]，而在正常胰腺组织中低表达[27]。Zhou等[28]在IONP表面连接有近红外荧光染料NIR830标记的IGF1抗体，并通过IONP表面的两亲性聚合物包裹化疗药物多柔比星(doxorubicin，Dox)构建了IGF1-IONP-Dox。由于胰腺癌细胞来源移植的动物模型在组织和病理学特征上与人胰腺癌有很大差异，因此不能有效预测探针的实际应用效果。有研究构建了病人来源移植(patient-derived xenograft，PDX)的动物模型，将手术切除的人胰腺癌组织小块种植于小鼠胰腺，发现小鼠瘤块的异质性及间质组成成分等均与人胰腺癌相似[29]，可见该模型可以很好地维持肿瘤移植物的多种组织学特性。将IGF1-IONP-Dox注入PDX模型小鼠体内，可以主动靶向肿瘤部位，并通过标记抗体的NIR830荧光显像，进一步证明了IGF1-IONP-Dox的良好靶向性。与无靶向性的IONP-Dox和游离Dox相比，在肿瘤部位的弱酸性微环境下，IGF1-IONP-Dox释放的Dox可以更有效地抑制肿瘤生长，验证了靶向性给药的可行性[28]。该研究的创新之处为采用PDX动物模型进行实验，且IGF1-IONP-Dox实现了磁共振与荧光双模态成像，以及成像与药物治疗的联合应用，其中Dox通过肿瘤部位的pH响应进行释放，而Yang等[22]构建的ATF-IONP-Gem通过酶响应性释放药物，为研究靶向性药物的传递提供了不同方案。

4.3整合素αvβ3整合素蛋白是一类细胞黏附受体家族蛋白，是由α和β两个亚基通过非共价键结合而成的异二聚体跨膜糖蛋白[30]。该家族共有24个成员，其中整合素αvβ3与多种癌症有关，是目前研究最多的家族成员。研究表明，整合素αvβ3在正常血管和其他正常组织中低表达甚至不表达，并保持休眠状态，但在多种肿瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞中却显著上调[31]。有文献报道，整合素αvβ3过表达极大地驱推动了肿瘤的生长、侵袭和转移[32]。

整合素αvβ3可以特异性结合线性、环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)三肽及含RGD三肽序列的多肽[33]。目前有研究表明，iRGD(CRGDK/RGPD/EC)这一细胞穿膜肽，不仅能主动靶向于αvβ3，还能增加肿瘤细胞的通透性，更有利于多肽本身或携带其他物质进入肿瘤细胞内，因此iRGD为肿瘤的主动靶向性成像或治疗提供了新方向[34]。Zuo等[35]构建了不同合成比例的iRGD-SPIO，与胰腺癌细胞共同孵育后进行T2加权成像，结果证明当SPIO比例不变时，随着iRGD比例的增加，T2信号逐渐降低，说明在iRGD的靶向作用下，SPIO更有利于聚集在胰腺癌细胞内；相较于游离SPIO，普鲁士蓝染色试验也证明了iRGD-SPIO可以更好地靶向胰腺癌细胞，但该实验未能在活体水平进一步验证。由于αvβ3在多种肿瘤中均异常高表达，因此有研究将RGD与SPIO联合应用，用于结肠腺癌[36]、恶性胶质瘤[37]和卡波西肉瘤[37]等疾病的诊断。

4.4去糖基化黏蛋白-1(mucin-1,MUC-1) MUC-1是由两个亚基组成的跨膜糖蛋白，在大多数上皮来源的肿瘤(胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等)内均异常高表达，且MUC-1在肿瘤细胞表面和细胞质均存在，分布范围较广[38]。在正常组织中，MUC-1高度糖基化，而在癌组织中去糖基化[39]，这一特征也使区分正常组织与癌组织成为可能。

Medarova等[40]在交联氧化铁纳米颗粒(crosslinked superparamagnetic iron oxide nanoparticles，CLIO)表面修饰近红外荧光分子Cy5.5，并结合去糖基化MUC-1的特异性肽链EPPT构建了CLIO-EPPT，用于胰腺癌的主动靶向性双模态成像，同时通过治疗前后双模态成像观察瘤块的大小变化，用于评估胰腺癌对于化疗药物5-氟尿嘧啶的治疗反应性，实现肿瘤的早期诊断和治疗的追踪与随访。由于去糖基化 MUC-1在多种肿瘤中均异常高表达，因此推测CLIO-EPPT也可用于其他肿瘤的早期诊断。

4.5其他相关受体 研究表明，表皮生长因子受体(epidermal growth factor recepter，EGFR)[41]、CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)[42]以及网格蛋白-1[43]在绝大多数胰腺癌中均异常高表达，且与肿瘤的发生、发展、侵袭以及转移密切相关。有文献报道，抗EGFR的单链抗体(ScFvEGFR)通过化学键连接在量子点(quantum dots，QDs)和氧化铁(iron oxide，IO)纳米颗粒表面，构建的ScFvEGFR-QDs和ScFvEGFR-IO均可以特异性主动靶向原位胰腺癌，说明了靶向配体在探针构建中的广泛应用[44]；He等[45]将CXCR4单克隆抗体连接在超小超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)纳米颗粒表面，构建了CXCR4-USPIO，研究探针的主动靶向性磁共振成像，以及利用磁共振T2强化率和ΔR2值半定量分析CXCR4的表达水平，为探针在细胞生物水平的应用提供了新思路；Chen等[46]构建的Plectin-SPION-Cy7以及Wang等[47]构建的dyeBSA SPION-mAb，用于胰腺癌的网格蛋白-1依赖性主动靶向以及磁共振与荧光联合成像，进一步证明双模态成像的优势。

5 小 结

胰腺癌的早期诊断与及时干预治疗一直是临床医师面临的一大难题，有限的治疗选择以及治疗效果不理想决定了实现胰腺癌早期诊断的重要性。分子影像学的出现使胰腺癌的早期诊断成为可能。研究表明，胰腺癌具有一系列高表达肿瘤标志物，而在正常胰腺或胰腺炎中几乎不表达，利用这些肿瘤标志物就可以区分胰腺癌与其他胰腺疾病，这为胰腺癌的精准医疗提供可能[48]。SPIO良好的生物学特性以及易于表面化学修饰的特征使其在磁共振成像相关分子影像研究领域广泛应用，若结合特异性肿瘤标志物，就可实现探针对于肿瘤的主动靶向；或结合荧光分子或化疗药物等，实现肿瘤的磁共振与荧光双模态成像或者靶向性治疗，从而可大大提高疾病的诊断率或治疗效果。目前已有结合不同肿瘤标志物的SPIO用于胰腺癌的早期诊断或靶向治疗的相关研究，并已取得一些成果。未来，分子影像用于胰腺癌的早期诊治将为精准医疗的实施提供新方向。