斑马鱼模型在病毒研究中的应用

谈文盼，卢欢倩，王晓桐，赵文昌，宋丽军

(广东医科大学药学院，广东 东莞 523808)

病毒感染性疾病是严重危害我国乃至全世界人民健康的传染病之一。目前，人们对病毒致病机制有一定程度的认识，但对病毒与宿主间相互作用方式以及病毒调节基因表达仍然需要进一步研究。采用相应的细胞培养和适宜的动物感染模型是病毒学研究的经典方法，但限于病毒的易感性及组织特异亲和性等，目前尚无合适的细胞培养体系和动物模型用于病毒研究。斑马鱼属于辐鳍鱼纲鲤形目鲤科短担尼鱼属的硬骨鱼，个体小、生长周期短、易于繁殖且早期胚胎透明[1-2]。由于斑马鱼与人类基因组、遗传、免疫高度相似，其被广泛应用于人类疾病(如肿瘤、阿尔茨海默病、心脏病以及细菌感染性疾病)的研究[3-5]。近年来，相继报道了病毒感染性疾病在斑马鱼中的研究[6-9]。斑马鱼具有可以实时观察示踪、基因编辑、高通量和高内涵的抗病毒药物筛选等优势，因此成为较好的研究病毒侵染的模式动物，为揭示宿主-病毒相互作用机制提供了较好的技术平台[10-11]。现就斑马鱼模型在病毒感染研究中的应用予以综述，以期为病毒的感染途径、机制、病毒与宿主的相互作用及抗病毒药物筛选等的研究提供理论依据。

1 斑马鱼的抗病毒免疫炎症机制

斑马鱼具有与哺乳动物类似的免疫器官、细胞以及免疫相关细胞因子和调控通路，同时具备先天免疫系统和适应性免疫系统，在病毒感染后会产生一系列的抗病毒反应[12-13]。炎症反应是维持细胞正常功能所必需的防御反应，而促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-8和白细胞介素-6等对促进炎症以及巨噬细胞和中性粒细胞向感染部位的趋化是必不可少的。例如，肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6在幼鱼中被诱导而导致斑马鱼全身感染鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)[14]。但炎症反应也需要精密控制，过度的炎症反应会对宿主造成伤害。许多病毒可以诱导细胞凋亡，病毒可以通过调节细胞凋亡逃避宿主细胞的免疫过程。例如，SVCV感染斑马鱼以巨噬细胞为靶点，白细胞介素-1β释放和细胞凋亡参与了病毒诱导宿主细胞死亡的全过程[15-17]。

除炎症因子外，斑马鱼的免疫相关调控通路亦与人类相似，通过对鱼类弹状病毒感染斑马鱼进行转录组和蛋白质组学研究发现，病毒感染斑马鱼后，Toll样受体、视黄酸诱导基因Ⅰ样受体等介导的干扰素反应以及补体途径等被激活，促分裂原活化的蛋白激酶、髓样分化因子88/核因子κB炎症信号通路等参与抗病毒应答的调控过程[18-19]，为人类病毒性疾病在斑马鱼身上的研究提供了可靠的免疫学基础。

基因编辑技术的发展促进了宿主抗病毒机制的研究。Liu等[9]通过基因编辑技术设计了叉头框O3B基因(forkhead box O3B，FoxO3B)-/-突变型斑马鱼幼鱼，并发现FoxO3B可以与干扰素调节因子3和干扰素调节因子7相互作用，抑制干扰素调节因子3/7的转录活性，从而使干扰素激活受到抑制；FoxO3B-/-突变型斑马鱼幼鱼感染SVCV后的抵抗力增强，并且病毒基因的表达水平低于野生型斑马鱼，表明FoxO3B基因参与了病毒感染的控制，并具有抑制病毒基因表达的功能。这些发现为揭示抗病毒免疫机制和病毒防治提供了研究基础。

2 与水产养殖业病毒相关的斑马鱼模型

在自然界中，目前尚无斑马鱼感染人类病毒，但鱼类病毒能够感染斑马鱼的幼鱼和成鱼，并导致疾病。SVCV、病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和蛇头鱼弹状病毒以及诺达病毒科病毒是引起鱼类传染病的重要病原[20]。由于这些鱼类病毒的最佳复制温度(通常低于24 ℃)较低，因此温度可能对斑马鱼的生长发育和免疫反应能力有一定的影响，但有研究显示，即使在15 ℃时斑马鱼仍然能够产生有效的抗病毒免疫反应[21]。因此，低温环境对病毒感染的斑马鱼免疫功能的影响还需要进一步的研究。

2.1RNA病毒

2.1.1弹状病毒科 弹状病毒科病毒是危害全球野生型和养殖型鱼类的主要病原之一。而SVCV是弹状病毒科家族中一种具有包膜的负链RNA病毒，感染后的鱼类出现眼球突出、腹部肿胀、皮下出血以及内脏淤血等[22-23]。SVCV可以感染斑马鱼成鱼和幼鱼，成鱼通过浸泡或腹腔注射感染，而幼鱼则常通过尾部血岛、尾静脉和卵黄等部位经显微注射或浸泡感染[24]。SVCV感染斑马鱼模型用于干扰素和炎症反应方面的研究取得了显著进展，被应用于肿瘤坏死因子-α阻断宿主的自噬反应研究中，突出了斑马鱼在研究抗病毒新药和宿主定向治疗方面的潜力，证实了Ⅰ型干扰素在斑马鱼中的抗病毒活性[25]。

最早在斑马鱼上进行研究的病毒——蛇头鱼弹状病毒，最初被应用于研究病毒Nonvirion基因的功能，成鱼常以腹腔注射方式感染，而胚胎则多以浸泡方式感染。利用转基因斑马鱼，Gabor等[26]证明了黑色素瘤分化相关基因5依赖性途径在抗病毒免疫中发挥着关键作用，为蛇头鱼弹状病毒感染机制的研究提供了新思路。另一个弹状病毒属成员——病毒性出血性败血症病毒，该病毒在春季或秋季流行，鱼类感染后最早在嘴、鳃、鳍部和皮肤开始出血，病毒性出血性败血症病毒感染模型已被用于疫苗和佐剂效价的研究，如感染前给予单宁酸可以降低斑马鱼的病死率[27-28]。此外，斑马鱼对水疱性口炎病毒易感，其感染对象主要是动物和昆虫[29]。水疱性口炎病毒不能通过浸泡或口服方式感染斑马鱼胚胎，神经毒性也严重阻碍着其作为临床药物的开发[30]。水疱性口炎病毒感染斑马鱼模型的建立，为未来水疱性口炎病毒的防治和抗病毒药物筛选奠定了模型基础。

2.1.2其他病毒科

2.1.2.1诺达病毒科神经性坏死病毒(nervous necrosis virus，NNV) NNV属于β诺达病毒属，NNV分布广、耐受力强、毒性大，感染后致死率非常高。NNV能够感染斑马鱼幼鱼和成鱼，成鱼常通过腹腔注射感染NNV，感染后的鱼漂游于水面，并伴有游泳不协调等典型的NNV感染症状[31]；而幼鱼的生存情况与感染方式有关，通过显微注射方式感染的幼鱼24 h后出现高死亡率，而浸泡方式感染幼鱼的生存情况取决于鱼的发育阶段，鱼龄偏大的幼鱼表现出更高的存活率[32]。进一步研究发现，Ⅰ型干扰素反应对生存率起着至关重要的作用，视黄酸诱导基因Ⅰ的剔除可导致感染NNV后的细胞炎症反应下调[33]。此外，作为研究病毒发病机制和神经元变性的潜在动物模型，已有研究利用NNV感染斑马鱼模型评估了结合病毒特异性纳米抗体和抗病毒药物的多壁碳纳米管靶向治疗病毒性中枢神经系统疾病的可行性[34]。

2.1.2.2传染性胰腺坏死病毒 传染性胰腺坏死病毒属于双链RNA病毒科的水生双链RNA病毒属，是已知鱼类病毒中最小韵RNA病毒[35]。传染性胰腺坏死病毒具有高传染性，感染后的死亡率高达90%，这种病毒给全世界水产养殖业带来了严重的经济损失[36]。LaPatra等[37]揭示了使用传染性胰腺坏死病毒进行基因转移实验感染斑马鱼造血细胞的潜力，这为造血细胞疾病模型提供了新的可能。虽然传染性胰腺坏死病毒可以感染斑马鱼，但仍然缺乏进一步的研究。目前尚无有效防治传染性胰腺坏死病毒的药物和疫苗，预防病毒暴发引起的死亡对水产养殖至关重要，可以通过研究斑马鱼获得的有效信息对疫苗进行改进。

2.2DNA病毒——虹彩病毒科 虹彩病毒科包括许多从昆虫和其他一些动物分离的胞质型DNA病毒。来自虹彩病毒科的传染性脾肾坏死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)和欧洲鲶鱼病毒(European salmon virus，ESV)可在斑马鱼上成功复制。实验室进行ISKNV感染主要采用腹腔注射的方式，感染后皮肤出现瘀点，鳞屑突出；自然条件下，ISKNV也能感染斑马鱼，感染后的鱼表现出嗜睡、食欲不振、游泳异常以及结肠腔扩张等，严重情况下甚至出现呼吸窘迫、腮鳍苍白和鳍底部出血等[6]。ISKNV可以刺激斑马鱼模型中干扰素调节因子7在斑马鱼脾脏中的表达增加，在免疫应答过程中起着类似转录激动剂的作用，同时还发现，鱼干扰素调节因子1对鱼类DNA病毒具有抑制作用[38-39]。此外，Qi和Xiang[40]发现，Daxx蛋白在斑马鱼的细胞凋亡和先天免疫中发挥一定的作用。这些发现为揭示抗病毒免疫机制和病毒防治提供了研究基础。ESV在斑马鱼上的应用较少，截至目前仅通过重组ESV方法证明了ESV可以有效感染斑马鱼[41]。表明斑马鱼可作为研究虹彩病毒发病机制的模型，用于探索其他基因在病毒和宿主间的相互作用以及新型鱼疫苗的研究。

3 人易感病毒的斑马鱼模型

近年来，学者探索了斑马鱼模型在人类病毒性疾病研究中的应用。斑马鱼体温和人类有一定差距，限制了该模型用于人类病毒性疾病的生物研究，但斑马鱼模型仍然成功用于许多人类病毒性疾病的研究[42]。目前，已经有单纯疱疹病毒1型、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒、甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)5种人类病毒斑马鱼模型被成功建立。

3.1RNA病毒

3.1.1甲病毒科 甲病毒属属于披膜病毒科，感染后往往引起儿童出血热综合征、关节痛、发热等症状，基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒是其中的两种。基孔肯雅病毒斑马鱼模型多用于研究病原体-宿主的相互作用。Palha等[43]通过静脉注射受精后3 d的幼鱼，成功建立基孔肯雅病毒感染斑马鱼模型，揭示了中性粒细胞在基孔肯雅病毒遏制中起至关重要的作用，感染后的斑马鱼可以恢复健康状态，且恢复程度依赖于宿主Ⅰ型干扰素的响应情况。该研究首次完成了对整个脊椎动物的体内成像，并成功观察到病毒感染的细胞生长和死亡的情况。由于基孔肯雅病毒主要传播途径是蚊虫叮咬，所以感染方式一般选择显微注射感染，这一发现为研究登革病毒或寨卡病毒等其他病原体提供了可能。辛德毕斯病毒是研究病毒性脑炎的公认模型，该感染方式同样模仿蚊虫叮咬的自然感染，且基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒感染斑马鱼所出现的症状相似，说明甲病毒科病毒感染疾病的发病机制是保守的。基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒均不依赖巨噬细胞介导的运输进入中枢神经系统，不同点在于基孔肯雅病毒总是先感染脑血管的内皮细胞，相比之下辛德毕斯病毒的轴突运输效率比基孔肯雅病毒高[44]。在实验研究过程中，斑马鱼作为模型可为研究脑病的发病机制和预防方法提供强大的可视化成像系统。

3.1.2其他病毒科

3.1.2.1正黏病毒科 正黏病毒科是指对人或某些动物红细胞表面的黏蛋白有亲和性的病毒，但实际上只有流行性感冒病毒一个种属，又称流感病毒群，人类IAV是其中的一种。IVA可以造成斑马鱼胚胎的全身性感染，并诱导产生抗病毒反应，通过荧光标记IAV，可实现病毒感染宿主整个过程的可视化。例如，将荧光标记的IAV显微注射到受精后2 d的斑马鱼胚胎中，观察到病毒感染血管内皮细胞的整个过程[45]。此外，由于斑马鱼感染IVA后引发的水肿、组织破坏等症状与人类临床病理症状相似，可利用该模型筛选抗病毒药物的有效性。研究发现，与正常个体相比，患有杜氏肌营养不良症的个体对IAV更易感[46]，说明在患有遗传性肌肉疾病的人群中预防IAV感染的重要性。

3.1.2.2HCV HCV属于黄病毒科，是一种具有脂质外壳的单股正链RNA病毒。据统计，全球约有1.85亿人感染HCV，感染率约为3%，每年新发HCV感染病例有300万～400万，严重危害人类的生命和健康[47]。HCV可以在斑马鱼上复制，且斑马鱼中HCV相关基因转录水平变化与感染人肝细胞后的变化一致[48]。另外，通过HCV感染斑马鱼模型还发现，人类自噬相关蛋白10的两种同工型对HCV亚基因组复制子具有相反的作用[49]。HCV感染斑马鱼模型除了可以作为药物筛选和评估模型外，更多的应用还需要进一步探索。

3.2DNA病毒——疱疹病毒科 疱疹病毒是双链DNA病毒，感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。单纯疱疹病毒属于疱疹病毒科α病毒亚科。目前单纯疱疹病毒主要分为1型和2型，1型主要由口唇病灶获得。通过单纯疱疹病毒1型感染斑马鱼模型，证明单纯疱疹病毒1型可以与宿主细胞的病毒表面糖蛋白D受体结合形成脂质体-病毒混合物，经过非受体介导的胞吞作用进入细胞[50]。表明脂质体介导病毒感染可在斑马鱼模型中实现以及病毒表面糖蛋白D受体可能增强基因治疗病毒载体的递送。除了可以作为脂质体介导的病毒感染模型外，单纯疱疹病毒1型斑马鱼感染模型还可作为研究胞质DNA感应机制的可行模型[51]。由于该病毒模型的文献报道较少，因此其后续应用和开发尚需进一步研究。

4 小 结

斑马鱼与人类的基因组具有高度相似性，其心血管、神经以及代谢系统的解剖生理学和分子生理学与哺乳动物非常相似，是一种理想的动物模型。随着转基因和基因剔除鱼研究的不断增多，利用斑马鱼构建病毒感染模型可深刻揭示病毒的侵染转化途径、宿主的病理变化以及与病毒相关的特定基因蛋白的功能，发现新的病理机制和新的靶点。在未来研究中，可以利用斑马鱼模型研究埃博拉病毒、诺如病毒、柯萨奇病毒等，特别是与遗传学发育生物学相关的病毒性疾病(如轮状病毒)等。同时，应尽快构建斑马鱼生长发育相关的体内、体表微生物以及病原体和组学研究，分析斑马鱼微生物组的组成等，确立不同洁净级别的斑马鱼，为病毒学的研究提供新的模式生物，为抗病毒药物的研究提供高效的技术平台。