长链非编码RNA与癫痫相关性研究进展

刘鹏鹏，宫玉哲，令调文，王天成

(兰州大学第二医院神经内科-癫痫中心，兰州730000)

非编码RNAs是一类不具备蛋白编码功能的RNA分子，作为表观遗传的重要因子参与基因的表达调控。非编码RNAs可分为微RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)等[1]。miRNA可通过多种调控方式参与包括癫痫在内的多种神经系统疾病的发生发展[2-3]。miRNA仅占非编码转录本的一小部分，而lncRNA在非编码RNAs中占比更大[4-5]。目前已鉴定出多种lncRNA，但其在哺乳动物神经系统中的功能还需深入研究。越来越多的证据显示，lncRNA在脑发育、成熟、神经分化、神经细胞特异性、神经再生、髓鞘形成、神经传递、突触可塑性中发挥重要作用[6-7]。已经有研究证明，lncRNA与阿尔茨海默病、癫痫等神经系统疾病相关[8-9]。

癫痫是一种常见的神经系统疾病，是遗传与环境因素共同作用的结果。大脑兴奋性异常可导致癫痫发生，而脑兴奋性与离子通道及递质受体密切相关。基因表达异常致通道开关和受体传递异常可导致神经元兴奋性的产生和传导异常，这可能是癫痫的病理生理基础。lncRNA作为非编码RNA中的重要一类，参与多种基因的表达调控，通过影响癫痫相关基因的表达，最终参与癫痫发生[9]。此外，lncRNA具有疾病特异性，不同疾病中特异性lncRNA的表达存在差异，提示lncRNA可作为癫痫诊断和预后判断的指标，同时也可作为治疗靶点，为癫痫的治疗提供新方向。现就lncRNA与癫痫的相关性进行综述，探讨其在癫痫发病、诊断、治疗等方面的应用前景。

1 lncRNA

1.1lncRNA的结构 lncRNA是长度大于200个核苷酸的转录本，来源于DNA模板链的转录，是哺乳动物基因转录组的重要组成成分[4]。根据lncRNA与附近蛋白编码基因的关系，可以分为基因内lncRNA、正义lncRNA、反义lncRNA等[1,10]。lncRNA定位在特定类型细胞和亚细胞结构中，大多定位于细胞核，并呈动态表达[11-12]。lncRNA因缺乏序列保守性，起初被认为是一种“转录噪音”[4]。随着测序技术的发展，越来越多的lncRNA被鉴定出来，并参与基因调控的多个步骤[13-15]，但其作用机制复杂，尚有待深入研究。

1.2lncRNA功能 lncRNA在基因转录、翻译以及蛋白功能等多个方面发挥作用。研究发现，lncRNA可通过沉默基因表达参与基因印迹和X染色体失活[14]。Ørom等[16]采用功能性敲除的方法对预筛的3 019种lncRNAs进行功能鉴定，确定了某些lncRNA对蛋白质编码基因的正向调控作用，具有类似于增强子的作用。目前已知的lncRNA的作用机制有：①与启动子结合，阻碍RNA聚合酶Ⅱ发挥作用，抑制下游基因表达；②诱导染色质重塑，使其易与转录因子结合，促进下游基因表达；③与正反义lncRNA结合，干扰剪切酶对信使RNA的剪切，进一步影响翻译；④产生内源性小干扰RNA，通过结合到相关基因转录关键部位，下调基因的表达；⑤与特异性蛋白结合，调节该蛋白活性；⑥是某些复合物的结构和组成成分；⑦影响蛋白定位，进而影响蛋白的正常功能；⑧是其他小分子RNA的前体[4-5,17]。lncRNA的功能具有多样性，其调控和作用靶点涉及基因表达的多个方面，对基因正常表达、蛋白正常发挥功能起关键作用。

2 lncRNA与癫痫发生

2.1lncRNA与神经分化 lncRNA存在于人体的各个系统组织中，功能注释表明40%的lncRNA在脑中差异表达[18]，并具有时间和空间表达上的特异性，某些lncRNA只在特定脑区表达[19]。随着高通量测序技术的发展，已经鉴定出多种神经lncRNA。lncRNA参与脑发育的多个过程，如神经元分化、突触重塑等[12,19]。通过对成年鼠脑室-室下区(ventricular-subventricular zone，V-SVZ)的神经干细胞进行研究发现，一些lncRNA是V-SVZ生发区长期自我更新和神经源性能力的基础[20]。由此说明，神经系统发育和神经疾病的发生与lncRNA的关系密切。

神经分化是一个精细的过程，需要对干细胞或祖细胞的增殖和分化进行精确的时空调控。研究表明，某些lncRNAs与神经元分化基因的调控密切相关，各种lncRNA的调控方式也不尽相同。长基因间非蛋白质编码RNA PNKY是一种含有825个碱基对的lncRNA，在神经组织中特异性表达，是调节胚胎和出生后大脑神经干细胞分化的调节因子，在V-SVZ的神经干细胞中富集，PNKY与信使RNA剪接调节子聚嘧啶带结合因子1相互作用，抑制神经分化相关基因的表达[21]。横纹肌肉瘤相关转录本2也是一种神经特异性lncRNA，与SRY盒转录因子2共同调控下游大量神经发生相关基因，两者均在神经组织中特异性表达，敲除横纹肌肉瘤相关转录本2显著抑制了神经发生，其正向调控神经分化[22]。同样的，Dlx5/6是关键的神经源性转录因子，lncRNA Evf2是其正常表达所必需的，lncRNA Evf2缺失将会导致神经元产生缺陷[23]。综上所述，lncRNA与神经发育和分化密切相关，异常的lncRNA可能会导致异常的神经发育，进而致病。

2.2lncRNA与突触 `神经突触形成是神经发育的重要部分，是建立正常大脑功能的结构基础。各种刺激诱导的突触重塑与正常脑功能的维持及疾病的发生发展相关[24-25]。癫痫是以突触连接为核心的神经疾病，由炎症、创伤等所致的继发性癫痫的形成与突触重塑关系更为密切，尤其是在颞叶癫痫中[26]。lncRNA参与了突触的形成和重塑。最早发现的与突触形成相关的lncRNA是BC1/BC200，在神经发育过程中其在树突处发挥作用，能够靶向抑制突触蛋白形成，该因子的异常可导致突触形成异常[27]。一些反义lncRNA调控几种重要的突触形成蛋白，包括脑源性神经生长因子(brain-derived neurotropic factor，BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子等，lncRNA BDNF-AS是BDNF的反义转录本，其能提高BDNF的蛋白水平，而BNDF水平的升高促进了神经元增殖、分化及突触形成。反义lncRNA通过调控局部基因的表达，调控神经元突触形成[28]。转移相关肺腺癌转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是另一个重要的突触形成因子。体外研究发现，MALAT1主动招募剪接蛋白到转录位点，以控制突触相关基因的表达，敲除MALAT1后突触密度降低，过表达后突触密度升高[29]。已经发现lncRNA钾电压门控通道亚家族Q成员2(voltage-gated potassium channel subfamily Q member 2，KCNA2)-AS通过与KCNA2结合，选择性下调KCNA2信使RNA和蛋白水平，调节损伤后神经突触的可塑性[30]，从而影响高级神经功能，这可能与慢性癫痫患者的皮质功能损伤相关。

2.3lncRNA与通道、受体 lncRNA也可通过影响离子通道和递质受体参与癫痫的发生，此类研究多集中在癫痫动物模型中。Luo等[31]研究发现，颞叶癫痫大鼠的非编码RNA中存在54个差异表达的lncRNA，功能分析显示这些lncRNA与电压门控钾离子通道活性和转运活性密切相关。Barry等[32]发现，lncRNA核富集转录体1通过与癫痫相关钾通道相互作用蛋白结合，调控神经元活性；用反义寡核苷酸功能性敲除lncRNA核富集转录体1后，诱导多能干细胞衍生的人类皮质神经元出现神经元超兴奋性表型，表明lncRNA核富集转录体1整体对神经元兴奋性起负调控作用。Li等[33]认为，lncRNA生长停滞特异性转录本5作为miR-135a-5p的竞争性内源性RNA，可以增加KCNQ3的表达，lncRNA生长停滞特异性转录本5沉默可以抑制癫痫的发生和进展。钙电压门控通道辅助亚基γ2(calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 2，CACNG2)是一种膜蛋白，通过调节α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体的功能和分布影响大脑兴奋性神经传递[34]。在动物模型研究中，小鼠反义lncRNA CACNG2可以调节CACNG2的表达，从而影响α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体的正常功能，进一步影响神经元兴奋性，参与癫痫发生[35]。

总的来说，lncRNA参与多个正常的神经生理过程，异常lncRNA可在转录水平影响正常基因的表达，从而影响神经兴奋性，导致癫痫发生。

3 lncRNA与癫痫诊断

lncRNA与癫痫的发生发展密切相关，且因lncRNA特异性的时间和空间表达以及进化保守性，提示可通过检测特异性的lncRNA协助诊断癫痫。很多研究表明lncRNA在癫痫组织和正常组织存在差异表达。有研究者采用癫痫小鼠模型研究皮质和海马区lncRNA和信使RNA的表达情况，最终确定了10种与信使RNA相关的差异表达的lncRNA[36]。Luo等[31]利用非编码RNA芯片检测发现，颞叶癫痫大鼠中有54个差异表达的lncRNA。已知移行细胞癌相关因子1(urothelial cancer associated 1，UCA1)是一种与膀胱癌发生发展相关的lncRNA[37]。Wang等[38]发现，癫痫大鼠脑组织与外周血中UCA1的表达均较正常组升高，且两者呈正相关，提示未来有可能通过检测外周血中的UCA1诊断癫痫。另一项研究发现，颞叶癫痫患者海马区的UCA1存在异常甲基化[39]。BDNF是重要的神经生长因子，lncRNA BDNF相反链可以负性调控BNDF[40]。Iughetti等[41]研究发现，癫痫患者放电高峰值区BNDF的表达上调，且外周血中的BNDF与脑组织中的BNDF同步升高，而lncRNA BDNF相反链可通过下调BNDF抑制BDNF介导的癫痫放电，提示外周血BDNF可作为判断癫痫严重程度的指标。

在癫痫患者中也检测到差异表达的lncRNA。Hashemian等[42]研究发现，癫痫患者外周血中lncRNA HOXA簇反义RNA 2和Sprouty RTK信号拮抗剂4内含子转录本1明显高于正常对照组。对儿童颞叶癫痫的研究发现，维生素D受体基因多态性与癫痫的发生相关[43]。Mazdeh等[44]则发现，癫痫患者外周血中维生素D受体相关lncRNA与正常对照组相比存在差异表达。由此可见，正常组织和癫痫组织中差异表达的lncRNA可能作为一种生物标志物为癫痫的诊断提供客观指标。

4 lncRNA与癫痫治疗

癫痫的传统治疗手段是药物治疗，但有30%的癫痫患者最终发展成难治性耐药性癫痫，癫痫频繁发作会对患者的身心健康造成严重损害[45-46]。因此，针对耐药性癫痫开发更多的新型治疗手段有重大意义。目前已知的新型治疗技术包括迷走神经刺激术、深部核团刺激术、经颅磁刺激技术、生酮饮食等[47]，基于lncRNA的基因疗法已成为一种潜在的治疗策略，并在部分动物实验中得到证实[33,48-49]。Dravet综合征是一种钠电压门控通道α亚基1(sodium voltage-gated channel alpha subunit 1，SCN1A)基因单倍体不足所致的遗传性癫痫性脑病[50]。Hsiao等[48]研究发现，利用寡核苷酸靶向反义lncRNA SCN1ANAT可以上调SCN1A基因的表达，改善癫痫表型，降低海马神经元兴奋性。Angelman综合征是由一种编码E3泛素连接酶的印迹基因UBE3A(ubiquitin protein ligase E3A)母系缺陷，而父系来源的UBE3A被lncRNA UBE3A-ATS沉默所引起的疾病，表现为精神发育迟缓、癫痫发作等，药物治疗效果差[51-52]。Meng等[49]研究发现，利用反义寡核苷酸特异性抑制模型鼠中lncRNA Ube3a-ATS维持神经元中Ube3a的非沉默状态，可改善Angelmen综合征相关症状。此外，lncRNA还可用于减少癫痫发作所致的脑损伤。在小鼠毛果芸香碱癫痫模型中，lncRNA UCA1可通过miR-495/核因子类红细胞2相关因子2通路，抑制癫痫小鼠海马神经元凋亡，从而抑制癫痫和癫痫后脑损伤[53]。Wu和Yi[54]研究发现，采用小干扰RNA下调lncRNA MALAT1可激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路，保护癫痫大鼠海马神经元免受自噬和凋亡的影响。Li等[55]也发现，进化保守的lncRNA FTX(five prime to XIST)在癫痫持续状态诱导的海马硬化过程中起抗神经元凋亡的作用。以上证据均表明lncRNA有可能成为癫痫治疗的新靶点。

5 小 结

随着基因技术的发展，非编码RNA靶向治疗作为一种新的治疗方式被不断研究。lncRNA在阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病等神经退行性疾病以及抑郁症等精神疾病中的研究已较为成熟，其可能为这些疾病的诊断、治疗以及预后提供帮助[56-57]。lncRNA通过参与神经分化、突触形成以及影响通道、受体等参与癫痫的发生发展，lncRNA可直接或间接影响癫痫相关基因，而lncRNA的失调参与了癫痫的发病。在癫痫患者和小鼠模型的脑组织中均检测到了特异性lncRNA的异常表达，且外周血中lncRNA与脑中lncRNA的变化呈正相关，提示外周血lncRNA可以反映脑内lncRNA的变化，其可作为癫痫诊断和判断预后的生物标志物。通过干预外周血中异常的lncRNA治疗脑内lncRNA异常所致癫痫可能是一种潜在的治疗策略，但其应用于临床诊疗还需要进行更深入的研究，不仅需要扩大样本量，重复动物实验，还需要进行大量的临床试验加以验证。高通量测序技术的发展必然会使研究者发现更多的癫痫相关lncRNA，通过转基因动物模型、诱导多能干细胞等技术研究其特异性功能，同时借鉴lncRNA在其他疾病中的应用模式，其在癫痫诊治中的应用将成为可能。

目前癫痫的诊断仍依赖临床症状和脑电图，部分依赖于基因检测，具备临床实用性的生物标志物仍然较少。癫痫治疗亦多局限于宏观治疗，分子靶向治疗研究较少。基因检测及编辑技术的发展使lncRNA可作为生物标志物应用于临床诊断，也可作为治疗靶点应用于临床治疗，而功能的多样性以及组织和疾病的特异性提高了其应用潜能。