脱细胞技术及其在眼表重建组织工程中的应用研究

陈芳圆，周清

(暨南大学附属第一医院眼科,广州 510630)

自1987年首次提出“组织工程”概念以来，人们开始尝试用组织工程学方法修复替代受损的眼表组织，组织工程角膜/结膜也随之产生，对于寻找合适的眼表重建替代材料非常重要。支架材料作为组织工程三大要素(支架材料、种子细胞、生长因子)之一，其构建是组织工程的关键环节。目前组织工程支架材料包括天然材料、生物可降解材料及人工复合材料三大类[1]。与其他支架材料相比，天然材料中的脱细胞基质具备以下优点：①良好的生物相容性、免疫原性和细胞黏附性；②为细胞提供合适的生存环境，在细胞发育过程中指导细胞增殖、分化、成熟和迁移[2]；③三维立体空间结构为细胞生长和代谢交换提供了空间。人们普遍认为天然材料是构建支架的理想材料。现就脱细胞支架的制备方法 (化学方法、物理方法和生物方法等)、脱细胞技术及其在眼表重建组织工程中的应用进行综述。

1 脱细胞支架制备方法

细胞外基质 (extracellular matrix,ECM)是指通过化学、物理、生物方法对组织器官进行脱细胞后，最终获得的结构和功能蛋白复合体[3]，即脱细胞支架。目前脱细胞基质构建的支架已成功运用于心脏[4]、肝脏[5]、肺脏[6]以及皮肤[7]等器官和组织。理想的脱细胞支架应该具备以下特点：①具有与人类正常组织相似的生物学特性；②无免疫原性；③无毒性；④具有功能性活性ECM。目前脱细胞的方法主要有化学法、物理法和生物法。

1.1化学制备方法

1.1.1表面活性剂 表面活性剂是最常见的脱细胞剂，通过破坏细胞膜磷脂裂解细胞，促使细胞膜溶解，破坏遗传物质，从而有效地从组织中去除细胞物质[8]。表面活性剂包括离子型、非离子型和两性离子型3种。表面活性剂对ECM蛋白和DNA的清除率随使用时间的延长而增加，并且多种活性剂联合使用会增加ECM蛋白的损失[9]。与酶和渗透溶液相比，非离子型表面活性剂如曲拉通Triton X-100常用于去除较厚组织的细胞成分[10]，减轻细胞免疫反应；但在较为致密的组织器官中，如肾[11]、颞下颌关节[12]，离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS) 的脱细胞效果优于非离子型表面活性剂，且保留了组织力学。脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate，SD)是另一种常用的离子型表面活性剂。与SDS不同，SD脱细胞基质具有高度生物相容性，表现出更高的代谢活性[13]，虽然SD对组织的破坏力较小，但其能引起组织表面DNA凝集[14]，因此SD溶液常与DNA酶 Ⅰ 合用，分解组织的天然DNA。两性离子型表面活性剂3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸能较有效地去除肺等较薄组织中的细胞，对于较厚组织，即使与SDS联合使用，脱细胞效果也可能较差[15]。

1.1.2低渗溶液与高渗溶液 低渗和高渗溶液通过改变细胞内的渗透压发挥作用。低渗溶液通过渗透效应松解组织，导致细胞膜破裂，从而达到脱细胞的目的，常与表面活性剂联合使用，提高溶细胞效果。在脱细胞后期，常使用高渗盐溶液增加核酸的溶解度以清除洗脱支架中残存的遗传物质。上述方法操作简便，但脱细胞效果不佳，且需时间较长，易造成组织水肿，故很少单独应用。

1.1.3酸/碱溶液 酸/碱溶液是通过催化水解细胞膜和细胞核获得脱细胞组织[16]。过氧乙酸是最常用的酸溶液，具有很强的腐蚀性和强氧化性，常用作杀菌剂，或用于较薄组织的脱细胞，如小肠黏膜下层[13]。与化学和酶消化法相比，碱性溶液在脱细胞过程中能完全消除基质中的生长因子，破坏胶原纤维，从而降低脱细胞基质片的机械性能[17]。碱性溶液常用于脱细胞早期去除真皮样品中的毛发[18]。

1.1.4醇类 甘油通过脱水和裂解细胞发挥脱细胞作用[19]，该方法主要适用于皮肤等含脂类较多的组织脱细胞。

1.2物理制备方法

1.2.1高静压技术 高静压技术是通过损伤组织中细胞的细胞膜，影响细胞内酶活力以及细胞内营养物质和废弃物的运输，从而使细胞裂解。与化学制备方法相比，高静压技术脱细胞过程中不添加化学溶液，避免了溶剂毒性对组织的损伤，且脱细胞所需时长较短,对血管或角膜组织脱细胞的效果优于表面活性剂和酶消化，但脱细胞过程中冰晶的形成会影响ECM的超微结构[20]。

1.2.2冻融法 冻融是利用低温(-80 ℃)冷冻过程中形成的细胞内冰晶破坏细胞膜，释放细胞内容物，然后再升至室温(37 ℃)融解，多次反复冻融使细胞结构破碎，从而达到脱细胞的目的。研究表明，脱细胞过程中多次冻融循环不影响ECM的超微结构，也不会减少ECM中的蛋白成分[21]。使用该方法时可加入冷冻保护剂，如5%海藻糖。单一冻融法无法获得较好的脱细胞效果，为制备高质量脱细胞基质常联合其他方法[22-23]。

1.3生物制备方法

1.3.1酶消化 目前用于脱细胞的酶包括核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、磷脂酶A2、嗜热菌蛋白酶、α-半乳糖苷酶、脂肪酶等，酶消化法具有高度特异性，但仅靠酶消化法很难彻底去除细胞，且残留在脱细胞支架上的酶可能会引起不良反应。核酸酶虽然是一种特异性的DNA或RNA降解酶，但由于分子量较大，使用后不易清除，残留的核酸酶可引起免疫排斥反应。胰蛋白是脱细胞常用的蛋白水解酶之一，常作为脱细胞的第一步，破坏组织亚显微结构，增加脱细胞剂的渗透力。胰蛋白酶可使脱细胞组织失去机械稳定性，其对ECM的破坏程度与作用时间成正比[24]。磷脂酶A2能够水解细胞膜的磷脂成分，且分子量较小，易清洗，可用于猪角膜的脱细胞处理[25]。蛋白酶对ECM的去除远大于对细胞膜的消化，其破坏了胞外基质间的连接，造成层粘连蛋白、纤粘连蛋白、蛋白多糖的大量丢失[26]。

1.3.2非酶类 螯合剂如乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸等能够与中心金属离子牢固地结合形成环状分子复合物，有助于细胞从ECM蛋白上解离，达到脱细胞的目的[27-28]。由于蛋白质之间的相互作用，螯合剂可能破坏蛋白质的超微结构[29]。

2 眼表组织脱细胞支架的制备

如上所述，脱细胞支架制备方法各有优缺点，一般采用两种或两种以上的方法联合脱细胞，在最大化脱细胞的前提下，更多地保存ECM的生理结构和生物活性,减少不良反应。联合多种脱细胞方法逐渐成为制备眼表组织(包括脱细胞角膜/结膜)脱细胞支架的主流，脱细胞试剂的选择取决于组织细胞的数量、密度、脂质含量和厚度[30]。

2.1脱细胞角膜基质 角膜疾病是第二位致盲原因,大部分为角膜基质缺损。对于角膜盲,角膜移植是唯一有效的方法[31],但因角膜移植供体缺乏,使其在临床应用中受到限制，研发有效的角膜代替品是解决角膜供体不足的重要方法，但诸多人工合成材料的效果均不理想[32]，于是人们将研究重点转向脱细胞角膜基质。

2.1.1化学与生物联合法 目前，获取脱细胞角膜基质最常用的方法是化学与生物联合法[25-26,30,33-36]。SDS是一种常用的离子洗涤剂。研究发现，用0.5%SDS制备的脱细胞角膜基质理化性质、组织结构和生物相容性更理想[37]，并认为角膜组织在0.5%SDS、4 ℃条件下处理24 h后能有效溶解角膜细胞和核膜[26,34,38-40],联合相关酶如0.25%的胰蛋白酶室温消化4 h[35],或用200 U/mL DNase-RNase 37 ℃降解48 h[30]，能清除残留在组织支架上的化学物质或酶,增强脱细胞效果。

张超等[35]用1%Triton-100联合0.25%胰蛋白酶、DNase-RNase对猪角膜进行脱细胞处理，扫描电镜下显示细胞成分去除干净，并保留了组织的三维网状结构。将脱细胞猪角膜植入新西兰大白兔角膜板层囊袋后未发生免疫排斥反应，基质位置良好，电镜下见基质与角膜组织间无缝隙，融合生长良好[35]。该研究为组织工程角膜研究奠定了基础。有学者曾多次用0.5%SDS+蛋白酶抑制剂脱猪角膜缘上皮细胞，结果发现，基质中DNA含量明显减少，三维超微结构保留完好，未出现化学溶剂毒性反应[30,34,40]。

2.1.2物理与化学/生物联合法 利用机械力破坏细胞可导致细胞溶解。虽然有学者报道仅用高静压技术(压强980 Mpa;温度10 ℃或30 ℃;时间10 min)就可制备脱细胞角膜基质[41-42]，但更多学者认为还需联合化学或生物方法,如联合1%～2%TritonX-100或40 U/mL DNase-Rnase等才能将细胞碎片等清除，从而得到较纯净的脱细胞角膜基质[22,42-44]。

Lin等[22]用反复冻融法联合2.5%胰蛋白酶和40 U/mL DNase-RNase酶消化法对猪角膜进行脱细胞处理，体外检测后将直径为6.5 mm的脱细胞角膜基质片植入12只新西兰大白兔的角膜基质层囊袋中，分别于术后第 1、4、8、32周切取全层角膜，结果发现，12只新西兰大白兔未出现临床和组织学排斥反应，在体内重建后脱细胞角膜基质与受体角膜结合并逐渐透明。

随着角膜组织工程技术的成熟，由我国研究开发的全球第一个可临床使用的生物工程角膜(艾欣瞳)于2015年5月正式投入临床[45]。该产品为脱细胞猪角膜基质,能促进角膜上皮再生及基质合成,减少新生血管生成,具有良好的生物相容性,且结构接近正常角膜基质,有利于细胞的长入，移植后能与原有的角膜组织整合,从而终身使用。

2.2脱细胞组织工程结膜 结膜是覆盖于眼睑后和眼球前的一层半透明黏膜，包括睑结膜、球结膜和穹隆结膜，主要功能是维持泪液动态平衡，是构成眼表的第一道防护线。当各种致病因素损害结膜上皮，特别是杯状细胞时，眼表屏障遭到破坏，致使泪液成分改变，泪膜不稳定，导致眼表功能丧失。过去有学者尝试用羊膜重建因化学烧伤、翼状胬肉手术后[46]、瘢痕性类天疱疮[47]以及Stevens-Johnson 综合征[48]等受损的眼表，但发现羊膜存在退化时间快、易于复发瘢痕以及瘢痕形成不足等缺点[47,49]。

目前脱细胞结膜基质技术尚未成熟，最常采用化学与生物联合法如0.05%～0.1%SDS联合1 U/mL核酸酶制备[50-52]。Kasbekar等[53]分别用浓度为0.05%(w/v)、0.1%(w/v)、0.5%(w/v)的SDS、1 U/mL核酸酶对人结膜进行脱细胞处理，结果发现，脱细胞结膜基质的DNA定量、胶原蛋白变性、细胞毒性以及抗张强度与天然结膜组织比较差异无统计学意义；3种浓度相比，浓度为0.05%(w/v) 的SDS可去除99%的DNA。将上述基质片干燥消毒后，体外培养人球结膜细胞28 d发现，支架可支持复层结膜上皮生长，并引导组织分化为上皮细胞和杯状细胞，证明其在眼表疾病的治疗中有潜在价值。

Zhao等[52]将角膜缘干细胞缺损模型分别在脱细胞结膜支架[0.1%(w/v)SDS]和脱细胞羊膜支架进行角膜上皮移植，并观察角膜生长情况。结果发现，脱细胞结膜组脱细胞结膜基质中92%以上的DNA被去除，同时保留了90%以上的ECM成分(糖胺聚糖和胶原)。与脱细胞羊膜相比，脱细胞结膜基质的透光率、抗拉强度、稳定性、生物相容性和抗降解能力更好，重建角膜上皮的效果也优于脱细胞羊膜支架组，证实了以脱细胞结膜为基础的组织工程化角膜上皮在角膜缘干细胞缺乏症的眼表重建中的有效性，为异种脱细胞结膜基质用于眼表重建奠定了基础。有研究发现，对于体内异种移植后结膜重建，猪源和人源脱细胞结膜优于羊膜[51,54]。

3 问题与展望

生物工程制备的脱细胞角膜基质作为较理想的角膜替代材料已开始应用于临床，但生物工程角膜材料的免疫原性在应用中是否会出现免疫排斥反应及出现免疫排斥反应后药物是否可控一直是眼科医师关注的焦点[55]。随着研究的深入,相信生物工程角膜能够在角膜眼表领域发挥更大的潜能，打破我国角膜供体资源不足的限制。但目前脱细胞结膜技术尚未成熟，对于严重结膜疾病患者缺乏有效的治疗方案，在以后的实验中探索更有效、标准化的脱细胞结膜方案，以实现最佳的ECM保存，深入探讨脱细胞结膜基质的制备，使脱细胞结膜生物成品的制作成为可能，为结膜疾病的诊疗提供新的方法。