定量蛋白组学技术在筛选急性主动脉夹层早期诊断标志物中的研究进展

买吐地·买吐逊，马翔

(新疆医科大学第一附属医院冠心病二科，乌鲁木齐 830054)

急性主动脉夹层(acute aortic dissection，AAD)是一种发病急、进展快、病死率高、严重危及生命的急危症，在急性发病后24 h内，每小时死亡风险增加1%[1]。尽早准确诊断并及时采取适当的治疗措施可显著降低AAD的病死率，改善远期预后，但由于AAD症状、体征复杂多变，往往很难与急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)、肺栓塞、急腹症等疾病早期鉴别[2]。目前AAD主要依靠C反应蛋白、D-二聚体、全主动脉CT血管造影(computed tomography angiography，CTA)及主动脉数字减影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)等检查诊断。其中CTA和DSA是目前AAD诊断的金标准，但DSA耗时长，有一定的创伤性，因此不作为AAD的常规检查手段。由于无创、诊断准确率高等优点，主动脉CTA一般作为AAD首选检查手段，但该检查耗时也较长，可能延误病情，故不适用于病情不稳定的AAD患者[3]。由于缺乏灵敏度、特异度高的早期诊断标志物，AAD快速诊断困难，因此筛选用于临床的早期诊断AAD诊断标志物，对防止患者病情进展具有重要意义[4-5]。蛋白组学是蛋白质与基因组学的结合，对基因组表达的绝大多数蛋白质进行精确的定量和鉴定，目前该技术主要常规用于发现新的生物标志物的研究中[6]。定量蛋白组学是蛋白组学技术的重要分支，被用来定量和识别基因组或复杂混合物中表达的所有蛋白质[7-8]。现就定量蛋白组学技术在筛选AAD早期诊断生物标志物中的应用价值予以综述。

1 定量蛋白组学技术的分类

1.1同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技术 iTRAQ技术是由美国ABI公司研发的多肽体外标记定量蛋白组学技术，该技术样本兼容性好，既可相对定量也可绝对定量，可同时对8组样本进行定性、定量比较，具有蛋白通量高、覆盖度高、自动化程度高等优点[9]。用于临床研究15年来，iTRAQ技术在国内外深受欢迎，目前应用iTRAQ试剂对血清、血浆、组织等样本进行高通量的液相二级质谱分析，获得一些对疾病有早期诊断价值的候选生物标志物，可为主动脉夹层、肝癌、前列腺癌、肺癌及乳腺癌等疾病的早期诊断、预后评估提供很大的帮助[10-11]。

1.2串联质量标签(tandem mass tag，TMT)技术 TMT标记是一种采用6-plex或10-plex同位素的标签进行串联质谱分析的多肽体外标记蛋白组学技术。TMT技术能同时比较2组、6组或10组不同样品中蛋白质的相对含量，具有较好的平行性，能避免技术误差，检测的样本可以多路复用，并可以创建具有高精度和最小缺失值的大规模数据集，提高差异蛋白检测效率[12]。与凝胶方法相比，应用TMT技术可以发现膜蛋白、核蛋白及胞外蛋白，对低丰度蛋白质亦有较好的检出率[11]。TMT技术目前在国内外广泛应用于筛选腹主动脉瘤、胰腺癌、乳腺癌等疾病生物标志物的研究中，筛选出了具有临床应用价值的生物标志物，为疾病的研究提供了新的方法和思路[12-13]。

1.3非标记定量(Label-free)技术 Label-free定量蛋白组学是一种不依赖于同位素标记的多功能新型定量蛋白组学技术，通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析，与iTRAQ、TMT技术相比，Label-free技术不需要稳定同位素标签作为内部标准，通过分析鉴定蛋白质时所产生的质谱分析次数或质谱峰强度比较不同样本中相应肽段的信号强度，就能估计不同样品之间蛋白质丰度的变化，对相应的蛋白质进行相对定量分析；Label-free技术目前已成为临床上用于筛选生物学标志物研究的高通量定量蛋白组学方法之一[14]。在所有用于差异化肽段定量分析的技术中，Label-free技术提供了最高的灵活性，并且由于软件和硬件设备的最新进展、更新，其使用范围越来越广，准确率也在不断提高[15-16]。与传统的3D-Label-free技术相比，新一代4D-Label-free蛋白组学技术在检测通量、深度、准确率方面同时获得了巨大的提升，可提供更高速度、更高灵敏度、更强大的分析性能，为蛋白组学与修饰组学分析带来了更高的灵敏度和速度[17]。

1.4细胞培养中氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)技术 SILAC是通过细胞培养物中的氨基酸进行稳定同位素标记的高通量蛋白测序的一种蛋白组学技术[18]。SILAC技术属于体内标记，标记效率高且稳定，无细胞毒性，样品无需预处理，不仅适用于进行全细胞蛋白质的分析，也适用于膜蛋白的鉴定和定量分析，其多功能性可以扩展到产生细胞内的标准来量化组织中低丰度的蛋白质，称为Super SILAC[19]。SILAC技术自2002年推出以来，就成为化学家和细胞生物学家进行生物学研究的常规方法以及定量蛋白组学研究、系统生物学研究的重要工具，广泛用于发现血浆生物标志物的研究中[20]。SILAC技术能够清楚地鉴定和量化在肿瘤发生中必不可少的蛋白质动力学，因此已广泛用于癌症蛋白组学的研究。例如，基于SILAC的质谱仪进行的全球蛋白组学分析提供了与乳腺肿瘤进展相关的蛋白质变化以及新的预后标志物信息；基于SILAC的定量蛋白组学的应用可以对人癌细胞间期和有丝分裂之间的表面蛋白质组进行详细评估，从而为抗有丝分裂的癌症化疗提供潜在的药效生物标记[21]。

1.5双向差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)技术 2D-DIGE是基于二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，D-PAGE)技术的定量蛋白组学技术，其分辨率和灵敏度高，变异性低，可以对样本间蛋白质丰度差异进行精确分析[22]。与传统的2D-PAGE技术相比，2D-DIGE技术中不同的样品分别用不同的荧光染料标记、混合，然后通过2D-PAGE分离，最后使用激光扫描仪对凝胶成像，因此2D-DIGE技术克服了凝胶间差异；此外2D-DIGE通过取消耗时的凝胶染色步骤提高了通量效率[23]。2D-DIGE技术具有可重复性、全面性、高通量等优点，提供了更快、更可靠的凝胶匹配，可精确地检测1 ng范围内的蛋白质含量，是目前广泛用于筛选肺癌、乳腺癌、系统性红斑狼疮等疾病早期诊断生物候选标志物及预测患者预后的常用工具，有助于促进精密医学的发展[24-25]。

1.6数据非依赖采集(data independent acquisition，DIA)技术 DIA技术是一种新颖、全息式定量蛋白组学技术，开启了高通量、全面定量蛋白组学的新领域，有效解决了鸟枪法、数据依赖性采集以及选择性反应监测技术存在的低丰度肽段信息丢失、重现性不佳、定量分析准确率不高等不足[26]。DIA技术操作流程简单有效，具有使用范围广、蛋白定量能力强、鉴定出的肽段和蛋白质的数量全面、无同位素标记要求、监测成本低等优点，可以对数千种蛋白质进行定量分析，提高了差异蛋白检测特异性，使检测蛋白缺失值更少[27]。DIA技术在目标蛋白组学领域具有广阔的应用前景，目前在诊断试验、疾病预后评估及候选生物标志物筛选研究中常规使用[28]。

1.7平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)技术 PRM是一种以四极杆-高分辨质谱平台、基于高精度质谱的靶向蛋白组学技术，能够对目标蛋白质进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质的绝对定量[29]。PRM技术是相对于传统选择性反应监测技术建立起来的高分辨监测技术，目前被认为是质谱定量的金标准，与蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫组织化学等传统的检测验证方法相比，PRM验证具有灵敏度和特异度高、高通量(一次可检测数10种蛋白)、准确率高、不依赖抗体、所需实验周期短等优点，在临床生物标志物的筛选研究中被广泛应用，是目前目标蛋白验证的主流方法[30]。随着蛋白组学技术的进一步进展，可以预见未来PRM技术的应用范围将进一步拓展，进而取代低分辨率的目标蛋白检测及验证技术[31]。

2 定量蛋白组学技术在筛选AAD早期诊断标志物中的应用

2.1iTRAQ技术与AAD 既往有研究报道，用iTRAQ技术对主动脉瘤患者血浆标本进行高通量筛选以寻找主动脉瘤早期诊断生物标志物[32]；Zhang等[33]使用iTRAQ技术对Stanford A型AAD患者和行冠状动脉旁路移植术的冠心病患者的升主动脉组织标本进行差异蛋白筛查，以寻找AAD患者早期诊断生物标志物，结果显示，相对于冠心病对照组，Stanford A型AAD组中共筛选出36种显著差异表达蛋白，其中19种蛋白表达水平显著下调，17种蛋白表达水平显著上调，差异表达率超过1.5倍(>1.5或<0.66)；他们用蛋白免疫印迹法进一步验证Fibrillin-1、Emilin-1、Decorin、DJ-1和Histone H4 5种差异蛋白在上述两类升主动脉平滑肌细胞中的表达水平，结果表明，与转化生长因子-β信号转导相互作用的Fibrillin-1、Emilin-1和Decorin三种重要蛋白通过转化生长因子-β信号通路导致细胞外基质重塑，可能参与AAD的形成。Xiao等[34]用iTRAQ技术分析AAD患者和健康对照组的血清样品，结果显示，164种蛋白达到定量标准，其中64种上调蛋白和61种下调蛋白差异表达率超过1.2倍；进一步扩大样本量，用AAD患者和表现为急性胸痛的非AAD患者血清标本验证上述差异蛋白，并选择差异表达率高的Lumican蛋白、C反应蛋白、血小板反应蛋白-1及D-二聚体作为候选生物标志物，探讨这些候选生物标志物对AAD的诊断价值，结果显示，AAD组中D-二聚体、Lumican的表达水平显著高于对照组；为了分析验证诊断试验的准确性，绘制了受试者工作特性曲线，Lumican和D-二聚体曲线下面积分别为0.895和0.891；采用Lumican和D-二聚体对AAD联合诊断，灵敏度为88.33%，特异度为95%；这些结果表明，Lumican和D-二聚体联合检测可以优化AAD诊断的灵敏度和特异度，能有效提高AAD早期诊断的灵敏度和准确率。另外，Gu等[5]用iTRAQ技术鉴定AAD的潜在血清生物标志物，将研究对象分为AAD组、AMI组和健康志愿组，从三组中收集血清样本用于iTRAQ分析，结果发现，相对于AMI组和健康志愿组，AAD组共鉴定出174种显著差异表达蛋白，其中46种蛋白差异表达率超过2倍；基于上述iTRAQ发现，他们选择了可能与血管损伤相关的Fibronectin蛋白和Lumican蛋白，用AAD和正常对照组血清对上述两种蛋白进行ELISA验证，ELISA初步分析发现，AAD组与对照组中Lumican蛋白表达水平比较差异有统计学意义(P=0.003)，而两组间Fibronectin蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P=0.685)；再进一步扩大样本量，用血清样品对Lumican蛋白进行ELISA验证，结果显示，相对于正常对照组和AMI组，AAD组Lumican蛋白水平显著增加，表明基于iTRAQ技术发现的Lumican蛋白是一种潜在的诊断标志物，可能有助于AAD的早期诊断。

2.2Label-free技术与AAD 近年来，Label-free技术广泛用于蛋白组学研究，有效提高了结肠癌、肺癌、乳腺癌等疾病诊断的准确率，极大地缩短了疾病诊断时间，为尽早精确诊疗提供了帮助[15]。王河清等[35]收集AAD患者和健康人血清各3份，进行Label-free检测，共鉴定出648种蛋白，通过t检验对数据进行分析[认定蛋白差异倍数>4.00或<0.25(P<0.05)为差异显著的蛋白]，得到了12种显著差异表达的蛋白，其中纽蛋白的差异表达率显著高于其他蛋白，并将纽蛋白设为夹层撕裂时主动脉壁释放出的特异性蛋白，因此纽蛋白被选为该研究的目标蛋白；进一步收集AAD患者、AMI患者和健康人血清各9份，对纽蛋白进行ELISA验证，同时收集AAD患者升主动脉组织进行免疫组织化学检测；ELISA验证结果表明，AAD组与AMI组和健康对照组相比纽蛋白水平并没有升高，而免疫组织化学结果发现，主动脉发生撕裂位置的纽蛋白分布较未发生撕裂位置密集，表明纽蛋白可能参与AAD的发病过程，是一种具有研究价值的AAD潜在生物标志物。

2.3PRM技术与AAD 马方综合征是由原纤蛋白-1基因突变引起的遗传性结缔组织疾病，有胸主动脉瘤和胸主动脉夹层发生的风险，且胸主动脉瘤破裂或胸主动脉夹层是马方综合征的主要死亡原因。Yin等[36]用质谱方法分析了胸主动脉瘤合并马方综合征组与胸主动脉瘤未合并马方综合征组患者的细胞外基质糖蛋白水平，并通过PRM技术对糖蛋白进行定量分析，首次证明了马方综合征患者中存在与原纤蛋白-1相互作用的微原纤维相关蛋白4(microfibril-associated glycoprotein 4，MFAP4)的异常糖基化，且合并马方综合征的主动脉瘤患者MFAP4糖基化作用较未合并马方综合征的动脉瘤患者显著增强；MFAP4在马方综合征患者的主动脉血管壁中表达丰富，其信使RNA水平在马方综合征患者升主动脉中显著升高，且高MFAP4血浆水平患者随访期间发生了Stanford B型主动脉夹层。证明MFAP4是一种有希望的候选血浆生物标志物，可用于识别发生Stanford B型AAD风险较高的马方综合征患者，对发生Stanford B型AAD风险较高的马方综合征患者进行更密切的监测以避免AAD的发生。

3 小 结

AAD是一种非常凶险的心血管疾病，由于缺乏快速、准确的检测手段，经常会贻误病情，失去最佳治疗时间窗，导致高病死率，对人类健康构成严重威胁。理想的生物标志物应具备非常高的灵敏度和特异度，且使用方便、安全、经济。目前对于AAD的快速诊断尚无可用于临床的理想生物标志物。通过定量蛋白组学已经筛选出许多AAD生物标志物候选物，但还未应用于临床。随着医学技术的发展，PRM、DIA、4D Label-free等新型定量蛋白组学技术将逐渐取代传统质谱技术，越来越多地应用于临床研究，使AAD生物标志物开发的效率及实用性进一步提高，筛选出具有高灵敏度、高特异度以及具有实际诊断应用价值的标志物，实现AAD的快速早期诊断，使AAD患者得到及时的治疗，降低病死率。