晚期糖基化终末产物对糖尿病结膜松弛症的影响

江 兵，徐智勇 ，王安素， 刘 苏

(1 遵义医学院附属医院 眼科，贵州 遵义 563099 ；2.重庆医科大学附属第二医院 眼科，重庆 400010)

晚期糖基化终末产物对糖尿病结膜松弛症的影响

江 兵1，徐智勇2，王安素1， 刘 苏2

(1 遵义医学院附属医院 眼科，贵州 遵义 563099 ；2.重庆医科大学附属第二医院 眼科，重庆 400010)

目的测定晚期糖基化终末产物(AGEs)在糖尿病结膜松弛患者结膜组织及血清中的含量，探讨其在糖尿病结膜松弛症发生过程中的作用机制。方法共收集结膜标本36份(糖尿病结膜松弛症6例9眼、单纯结膜松弛症5例9眼、糖尿病不伴结膜松弛症者9例9眼和正常人9例9眼)，血清标本29份(每人静脉采血),采用竞争性酶联免疫吸附试验法(ELISA)定量测定其AGEs含量。结果在糖尿病结膜松弛组、糖尿病组两组血清AGEs含量(ng/ml)分别为17.5525± 4.1593和15.7092±3.1896，明显高于结膜松弛组和正常结膜组的12.0809± 3.2551和9.0161± 2.4255，差异有统计学意义(P<0.05)；在糖尿病结膜松弛组与糖尿病组、结膜松弛组与正常结膜组病组，血清AGEs含量差异无统计学意义(P= 0.089)。结膜组织中AGEs含量在糖尿病结膜松弛组(0.4240 ± 0.0903)、糖尿病组(0.3436 ± 0.0780)、结膜松弛组(0.2682 ± 0.0410)、正常结膜组(0.1895 ± 0.0176)依次降低，各个组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论血清及结膜中AGEs水平升高与糖尿病结膜松弛症密切相关，高糖环境和AGEs蓄积可能在糖尿病结膜松弛的发生和发展中起到重要作用。

结膜松弛症；糖尿病；晚期糖基化终末产物

结膜松弛症是由于球结膜过度松弛,造成松弛的球结膜堆积在眼球与下睑缘、内、外眦部之间形成皱褶,引起眼表异常的一组疾病[1]。常发生在老年人[2]，有人发现用药物治疗降眼压的青光眼患者结膜松弛症发病率较高[3]，也可见于二尖瓣脱垂综合症患者[4]。在临床眼表疾病的诊治过程中，发现很多糖尿病患者出现干涩、异物感等症状，部分合并球结膜松弛。迄今为止关于结膜松弛症的病因及发病机制尚无一种公认的理论，有研究认为其发病机制可能与氧化应激、细胞凋亡及炎性介质介导的炎性反应等有关[5-6]。研究表明AGEs浓度的升高与糖尿病及其并发症密切相关[7]，本研究通过对糖尿病结膜松弛患者血清及结膜中晚期糖基化终末产物的含量进行研究，探讨其在糖尿病结膜松弛症中可能的致病机理。

1 资料与方法

1.1 试剂 人糖基化终末产物(AGE)ELISA试剂盒(Uscn 美国)。

1.2 标本收集与分组 收集2007年1月至2007年12月、重庆医科大学附属第二医院眼科门诊和住院的患者共29例(36眼)，按照1999 WTO 糖尿病诊断标准和张兴儒眼结膜松弛的临床分级标准[8]分成如下四组。糖尿病结膜松弛组：结膜松弛程度Ⅲ级-Ⅳ级同时合并2型糖尿病的患者6例(9只眼)，其中男2例，女4例，平均年龄64.34±7.54岁，结膜松弛症病程2～4年,糖尿病病程3～10年。结膜松弛组：结膜松弛程度Ⅲ级-Ⅳ级，不伴有其他疾病的患者5例(9只眼)，男性2例，女性3例，平均年龄71.20±8.03岁，结膜松弛病程8个月～6年。糖尿病组：年龄、病程与糖尿病结膜松弛组相匹配的2型糖尿病合并白内障需要行手术治疗患者9例(9只眼)。正常结膜组：年龄与前两组相匹配的年龄相关性白内障患者9例(9只眼)，均无其它眼疾患及全身疾病。

空腹静脉血标本1000转/ min离心5 min，取上清液500 μL放入-80 ℃低温冰箱待检。

糖尿病结膜松弛组和结膜松弛组患者，用平镊将松弛的球结膜自角膜缘向内眦及下方穹隆轻压抚平，在距离角膜缘6～7 mm处提钳夹捏提起球结膜组织，估计欲切除的多余结膜组织量。新月形剪切除下方松弛多余结膜组织作为测量组织中AGEs的实验标本，8-0可吸收缝线间断缝合结膜切口并固定于结膜切口下浅层巩膜。糖尿病组和正常结膜组的患者，行囊外白内障摘除手术过程中沿手术切口部位取对应部位球结膜(取材前均征得患者书面同意)。球结膜组织取下后立即电子天平称重，锡箔纸包裹放入密闭玻璃瓶中置于-80 ℃冰箱。待球结膜标本搜集齐后，加入低温PBS倍比稀释，低温超声组织破碎，冷冻离心机(Z 233MK-2 Sigma)8250转/ min、4 ℃ 冷冻离心15 min后取上清液200 μL放入-80 ℃冰箱待检。

1.3 实验方法 采用竞争性酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定AGEs，结果以ELX800型自动酶标检测仪测定450 nm处吸光度值，计算AGEs在血清和组织中的水平。严格按说明书步骤进行操作。

2 结果

2.1 血清中糖基化终末产物含量 AGEs在糖尿病结膜松弛组、糖尿病组两组血清中含量明显高于结膜松弛组、正常结膜组血清AGEs含量，有统计学差异(P<0.05)。糖尿病结膜松弛组与糖尿病组之间，结膜松弛组与正常结膜组之间血清AGEs含量却没有统计学差异(P>0.05)。

组别例数AGEs糖尿病结膜松弛组617.5525±4.1593结膜松弛组512.0809±3.2551b糖尿病组915.7092±3.1896正常结膜组99.0161±2.4255b

注：b：与糖尿病结膜松弛组比较，P<0.05。

2.2 结膜组织中糖基化终末产物含量 糖尿病结膜松弛组、糖尿病组、结膜松弛组、正常结膜组4个组球结膜组织中AGEs含量依次降低，各个组间差异都有统计学意义。

组别AGEs糖尿病结膜松弛组0.4240±0.0903糖尿病组0.3436±0.0780b结膜松弛组0.2682±0.0410c正常结膜组0.1895±0.0176d

注：b：与糖尿病结膜松弛组比较，P<0.05；c：与糖尿病结膜松弛组比较，P<0.05；d：与糖尿病结膜松弛组比较，P<0.05。

3 讨论

晚期糖基化终末产物(AGEs)是在没有酶参与的条件下，蛋白质、脂类、核酸等生物大分子物质自发地与葡萄糖及其它还原糖反应产生的共价加成物[9]。非酶促糖基化反应在正常机体即缓慢进行，其形成的AGEs不可逆，AGEs水平随年龄增长而缓慢增加。Pamplona等[10]研究证实，持久的高血糖会导致人体内许多核酸蛋白、结构蛋白和功能蛋白发生非酶促糖基化，形成不可逆的晚期糖基化终产物。在糖尿病持续高血糖情况下，这一反应的速度显著加快，AGEs形成量明显增多。本研究发现血清AGEs含量在糖尿病结膜松弛组、糖尿病组两组中显著高于结膜松弛组、正常结膜组，与Pamplona等研究相符。

现代组织学研究证实结膜固有层有I型胶原纤维和Ⅲ型胶原蛋白构成的网状纤维和弹力纤维等细胞间质成分。胶原是第一个被发现通过AGE修饰形成分子内共价交联的基质蛋白。有研究发现，在高糖环境下，葡萄糖分子迅速与胶原分子中赖氨酸和羟基赖氨酸的ε氨基发生非酶糖基化反应生成AGEs，并且胶原发生糖基化后其生物和物理特性均发生了变化，不易被酶和酸所降解。在非酶糖基化反应的过程中，体内的还原性谷胱甘肽、VitE、Vitc的水平显著降低，还引发胶原的合成障碍。本实验发现在糖尿病患者结膜组织中AGEs异常升高，表明其结膜中胶原质和量可能发生了改变。Daniel Meller认为胶原纤维的溶解可能是导致结膜松弛症的病理过程，弹力纤维的变性可能是造成结膜松弛症形成的病理生理学说[11]。糖尿病患者结膜固有层中的胶原在高血糖环境下发生非酶糖基化反应导致结膜组织中AGEs增多、胶原变性及胶原合成减少，网状纤维和弹力纤维也会发生变性和减少，促使糖尿病患者结膜松弛的发生。

AGEs具有广泛的致病作用。AGEs形成后引起蛋白质分子间广泛交联可从多个方面影响机体，如引起血管通透性增大、血管基膜增厚和细胞外基质积聚等[12-13]。糖尿病患者结膜血管通透性增加后血液中的AGEs更多的进入结膜组织中。近期研究表明，人血管内皮细胞膜上表达多种特异性的AGEs受体(RAGE)，AGEs与RAGE结合后可引发细胞内氧化应激、亚铁血红素加氧酶1的表达和转录因子(NF一κB)的激活，同时还可进一步增强AGEs受体表达，引起持续的细胞损伤和功能紊乱14]。此外，AGEs在组织中的水平还与RAGE在组织分布的特异性有关。有研究[15]显示，糖尿病患者体内成纤维细胞膜上RAGE持续高表达。在糖尿病患者结膜固有层中成纤维细胞膜上RAGE可能持续高表达，结膜组织中AGEs水平也增高。本实验中糖尿病结膜松弛患者结膜组织中AGEs含量明显高于其他三组，可能与血糖水平高、结膜组织固有层胶原相对丰富、血管通透性增加以及结膜组织中成纤维细胞膜上RAGE持续高表达有关。有人将大鼠尾键胶原与葡萄糖或核糖混合孵育7周，发现胶原纤维间的距离加大，认为与AGEs与RAGE结合后可引发氧化应激有关。该现象与糖尿病结膜松弛中胶原变化极为相似。我们推测结膜组织AGEs与RAGE结合后，导致氧化应激，细胞损伤，进而引起糖尿病结膜松弛的发生。本实验中糖尿病无结膜松弛患者结膜组织中AGE较单纯结膜松弛患者高，可能糖尿病患者体内RAGE高表达有关。对于单纯结膜松弛症AGE低于无结膜松弛症的糖尿病，提示结膜松弛除与AGEs有关，可能还有其他致病因素，如Li等[16]报道了结膜松弛症与基质金属蛋白酶的过度表达和增生活跃有关。

葡萄糖浓度升高，使血清、球结膜组织中的AGEs异常增加，AGEs在结膜组织中蓄积，AGEs对结膜血管内皮细胞的损害、固有层胶原糖基化、氧化应激损伤等，导致结膜组织细胞赖以生存的空间结构发生相应的改变，同时引起结膜组织细胞生存的微环境理化性质的紊乱，促使糖尿病结膜松弛的发生、发展。

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Effectofadvancedglycationendprodutsindiabeticconjunctivochalasis

Jiangbing,Xuzhiyong,Wangansu,Liusu

(1.Department of Ophthalmology，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China;2.Department of Ophthalmology，The Affiliated Second Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China)

ObjectiveThis study was to investigate the level and role of AGEs in diabetic conjunctivochalasis.MethodsThe levels of AGEs were assessed by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in 36 conjunctive tissue samples and 29 serum samples which were collected from the patients with diabetic conjunctivochalasis (9 eyes of 6 cases), only conjunctivochalasis (9 eyes of 5 cases), diabetes without conjunctivochalasis (9 eyes of 9 cases) and normal subjects

extracapsular extraction (9 eyes of 9 cases).ResultsMean levels of serum AGEs (ng/mL) in diabetic conjunctivochalasis and diabetes were 17.5525±4.1593 and 15.7092±3.1896, showing a significantly higher level than those of only conjunctivochalasis group and normal conjunctiva group (12.0809±3.2551, 9.0161±2.4255) (P<0.05). There was no statistically significant difference in the level of serum AGEs in diabetic conjunctivochalasis group and diabetes group(17.5525±4.1593 vs 15.7092±3.1896), conjunctivochalasis group and normal conjunctival group (12.0809±3.2551 vs 9.0161±2.4255).The levels of AGEs (ng/mg) in conjunctive tissue decreased gradually in diabetic onjunctivochalasis group(0.4240±0.0903)， in diabetes group(0.3436±0.0780)，conjunctivochalasis group(0.2682±0.0410) and normal conjunctival group(0.1895±0.0176). There was statistically significant difference in the level of AGEs in conjunctive tissue between any two group (P<0.05).ConclusionThe higher levels of AGEs in serum and conjunctival tissue were closely correlated with diabetic conjunctivochalasis. High glucose and AGEs accumulation may play a critical role during the occurrence and development of diabetic conjunctivochalasis。

conjunctivochalasis;diabetes;aadvanced glycosylation end products

重庆市教委科学技术研究基金项目(NO：KJ060319)。

R544.1

A

1000-2715(2013)05-0449-04

[收稿2013-06-15;修回2013-08-17]

(编辑：谭秀荣)