外泌体在骨再生中的应用研究进展*

况慧娟，刘世宇，金 岩

（第四军医大学口腔医院/军事口腔医学国家重点实验室/口腔疾病国家临床医学研究中心/陕西省口腔疾病国际联合研究中心，西安710032）

骨缺损是骨结构完整性受到破坏的骨科常见疾病，创伤、感染、肿瘤等是导致骨缺损的主要原因[1]。目前临床治疗骨缺损的方法主要通过自体骨移植或异体骨移植，但自体骨移植存在来源有限等缺陷，而异体骨移植也因感染或排斥等因素而导致并发症的出现[2]。因此，如何促进骨缺损组织的再生修复是亟待解决的问题。近年来，细胞移植和生物材料在骨组织再生中发挥重要作用，但细胞移植存在一定的潜在风险，如引起血栓或其他并发症等问题[3]，而生物材料的安全性和有效性也有待进一步考量[4]。因此，越来越多的研究转向同样具有组织修复功能的外泌体（exosomes）。外泌体是一类由细胞分泌的膜性微型囊泡，参与细胞间通讯并调控靶细胞的生物学功能[5]，可调控骨再生中相关细胞的活性，有望成为解决骨再生的潜在治疗方法。本文主要围绕外泌体在骨再生领域的应用进行综述。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的形成和来源 外泌体是由多胞体（multivesicular body，MVB）与细胞膜融合后由细胞主动分泌到细胞外，直径为30～100 nm 的胞外囊泡。当MVB 内陷形成内囊泡时，由ESCRTs 蛋白组成的复杂蛋白网络结构可促进MVB 形成和囊泡出芽，同时将一些特定的蛋白纳入到内囊泡内[6]。此外，跨膜蛋白也参与外泌体的生物形成和其中蛋白质的负载。研究表明，细胞内四跨膜蛋白的微区可与ESCRTs 作用促进内囊泡的形成[7]，并与CD81 相互作用将蛋白质分选至外泌体内[8]。最近研究揭示了另一种ESCRT 途径，即syndecan-syntenin-ALIX 途径。由于ALIX 结合几种ESCRT 蛋白，因此Syntenin 与ALIX 相互作用促进内囊泡的形成，随之在硫酸乙酰肝素调控下促进内囊泡的出芽，并将syntenin-1、syndecan 和CD63 蛋白分选至外泌体内[9]。除ESCRTs 途径外，有研究表明脂质在外泌体的形成过程中也发挥重要作用。在外泌体的膜结构中富含鞘磷脂酶，后者水解形成神经酰胺，促进内囊泡的出芽[6]。T 细胞、内皮细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞等几乎所有的活细胞都能分泌外泌体，在血液、尿液、唾液中都能检测到外泌体。

1.2 外泌体组成 外泌体中含有蛋白质、核酸、脂质等多种成分，但其组成与细胞类型、细胞生理状态以及囊泡的生物形成方式有关。蛋白组学表明，外泌体内含有四跨膜蛋白（CD63、CD81、CD9）、参与免疫应答的抗原呈递蛋白（MHCI 和 MHCII）[10]、参与膜转运和融合蛋白（GTPases、Annexins、flotillin）以及热休克蛋白（Hsp70 和 Hsp90）[11]，这些蛋白也常用于外泌体的鉴定。除蛋白质外，外泌体还含有多种核酸遗传物质。少数细胞如星形胶质细胞和胶质母细胞瘤细胞来源的外泌体含有线粒体DNA[12]。除DNA 外，外泌体还富含 mRNA、miRNA、tRNA、rRNA 等小 RNA。研究表明，miRNA 是外泌体参与细胞信号传递和细胞间交流的主要生物活性物质。miRNA 是一类非编码的小RNA，与其靶向分子一同调控生物体的生理活动。囊泡内miRNA 比游离miRNA 具有更长的半衰期和较高的稳定性，因此miRNA 在外泌体脂质双分子层的保护下，能更好发挥对靶细胞的调节作用[13]。由于miRNA 在外泌体内的稳定性，可作为某些疾病的诊断标志物。外泌体的双层膜结构还富含胆固醇、甘油二酸酯、甘油磷脂、磷脂和鞘脂或糖基神经酰胺（包括鞘磷脂和神经酰胺）等脂质分子[14]。除了维持外泌体的稳定性，脂质也可作为某些疾病如前列腺癌的生物诊断标志物[15]。

1.3 外泌体的释放 与外泌体形成机制类似，外泌体释放也存在多种机制。众多研究表明，Rab 家族在调控外泌体释放中起着重要作用。将过表达Rab11突变体转染至白血病K562 细胞中，可抑制细胞外泌体的释放[16]。抑制 Rab2b、Rab5a、Rab9a、Rab27a 和Rab27b 蛋白表达后，Hela 细胞外泌体的分泌量大量减少，其中Rab27a 和Rab27b 的缺失效应更明显[17]。除了Rab 蛋白家族，SNARE 蛋白也是外泌体释放中另一个重要调控分子。在肾HEK293 细胞中，SNARE蛋白 YKT6 可通过 TSG101、WNT3A 和 VPS26/35 调控外泌体释放[18]。此外，突触蛋白也可影响MVB 与细胞质膜的融合[19]。细胞内存在多种调控外泌体分泌的效应分子，更深入研究其机制有助于对外泌体的全面认识。

1.4 靶细胞对外泌体摄取方式 外泌体能识别靶细胞并被靶细胞摄取是其发挥调控作用的前提。外泌体被靶细胞摄取的可能机制之一是外泌体的膜与靶细胞的细胞质膜直接融合[20]，外泌体膜上的类脂筏状膜有助于与细胞膜融合[21]。第二种可能的摄取机制是内吞作用，内吞作用分为网格蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白介导的内吞作用、脂质筏介导的内吞作用、巨胞饮作用和吞噬作用。根据受体细胞类型，外泌体的摄取机制不同。肿瘤细胞来源的外泌体通过网格蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用被骨髓间充质干细胞摄取[22]。B 淋巴细胞对外泌体的摄取主要是依赖胆固醇介导[23]。血管内皮细胞摄取外泌体主要由小窝蛋白发挥作用[24]。细胞摄取外泌体的第三种可能机制是通过特定受体-配体相互作用介导。有研究发现，白细胞亚群对胰腺癌细胞外泌体摄取的差异取决于白细胞粘附分子，腹膜渗出细胞对外泌体的摄取量最多，淋巴细胞和粒细胞次之[25]。牛奶来源的外泌体表面MUC1 蛋白可与树突细胞DCSIGN 蛋白特异性结合，从而被树突细胞吞噬。但血清来源的外泌体不存在MUC1 蛋白或其他可能与DC-SIGN 蛋白结合的糖蛋白，因此无法被树突细胞吞噬[26]。

2 外泌体在骨再生中的作用

2.1 外泌体与血管生成 骨是高度血管化的组织，依赖血管和骨细胞的紧密联系来维持骨的完整性，血管生成在骨再生中起重要作用。研究发现，内皮祖细胞外泌体通过传递miR-126 促进内皮细胞的增殖、迁移和血管生成能力，提高大鼠胫骨周围的血管密度，从而有效加快骨缺损中骨再生进程[27]。对股骨骨折大鼠注射间充质细胞来源外泌体，可促进内皮细胞增殖、迁移、管腔形成和血管生成，加快骨折愈合。进一步研究显示，外泌体通过诱导HIF-1α 促进血管内皮生长因子（VEGF）的表达，从而促进骨再生[28]。此外，星形胶质细胞外泌体含有多种抗血管生成的成分如内皮抑素等，可有效抑制新生血管的生成[29]。另一项研究证实，外泌体可通过miR-9 抑制其靶基因MDK 表达，并同时调控PDK/AKT 信号通路来抑制内皮细胞的迁移和增殖，从而抑制新生血管的生成[30]。因此，外泌体来源的选择以及如何提高外泌体促进血管生成的能力尤为关键。研究表明，缺氧条件可调控外泌体内生物活性物质的表达，从而在不同微环境中促进血管生成。慢性缺氧条件下多发性骨髓瘤细胞分泌的外泌体内miR-135b 高度表达，而miR-135b 可靶向内皮细胞内FIH-1/HIF-1信号通路，从而加速血管生成[31]。缺氧预处理后，间充质干细胞外泌体可增加促血管生成、增殖和迁移的miR-126 的表达，从而促进骨折愈合进程[32]。除缺氧外，生物材料也可提高外泌体的促血管生成能力。一种含锂生物材料可诱导外泌体内miR-130a 表达，随之激活PTEN/AKT 信号通路，最终促进骨骼再生中的血管生成[33]。综上所述，外泌体与骨组织再生血管形成有关，恰当选择外泌体来源及调控外泌体内生物活性物质的表达，有望成为促进骨再生的有效治疗手段。

2.2 外泌体与成骨细胞 骨的生长发育和再生与成骨细胞密切相关。成骨细胞由骨髓间充质干细胞分化而来，负责骨的形成、重塑和愈合。成骨细胞的增殖、分化受激素、蛋白质、miRNA 等因素的调控，而外泌体可调节成骨细胞的增殖分化来促进骨再生。骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过携带miR-122-5p 激活MAPK 信号，提高受体酪氨酸激酶活性，促进成骨细胞的增殖和分化，从而改善骨质疏松缺损的骨再生[34]。间充质干细胞外泌体可增强成骨细胞内成骨基因的表达和碱性磷酸酶活性，促进大鼠颅骨缺损的骨再生[35]。经骨形态发生蛋白2（BMP2）刺激后，巨噬细胞外泌体可明显增大成骨细胞内成骨分化标志物ALP 和BMP2 表达，从而通过增加成骨细胞的增殖分化来促进骨再生[36]。当TNF-α 预处理脂肪组织3 天后，脂肪组织外泌体内Wnt-3a 蛋白上调，可显著增强人初代成骨细胞的增殖和成骨分化能力，从而促进骨修复和骨再生[37]。此外，成骨细胞外泌体也具有促进骨形成的潜在机制。骨髓基质细胞吞噬矿化成骨细胞外泌体后，细胞内91 种miRNA 表达上调，182 种miRNA 表达下调。进一步研究发现，矿化成骨细胞外泌体通过miR-667-3p、miR -6769b -5p、miR -7044 -5p、miR -7668 -3p 和miR-874-3p 共同靶向Axin1 基因，随之促进βcatenin 表达并激活Wnt 信号通路，导致骨髓基质细胞向成骨细胞分化，增强成骨作用[38]。成熟成骨细胞外泌体可激活内皮细胞VEGF/Erk1/2 信号通路，增强内皮细胞增殖、迁移和血管生成，间接促进骨再生[39]。对成骨细胞外泌体进行蛋白组学分析，发现其中786 种蛋白质参与直核起始因子2 通路、mTOR通路等成骨通路，因而具有成骨潜能[40]。对小鼠Mc3t3细胞外泌体进行蛋白组学分析，在鉴定的1 536 种蛋白质中有172 种蛋白质与骨骼数据库重叠，蛋白网络分析显示外泌体内的蛋白质与骨骼肌系统的发育和功能、发育障碍、遗传性障碍和成骨途径相关，并且 EFNB1、转化生长因子 β 受体 3、LRP6、骨形态发生蛋白受体1 型和SMURF1 在成骨中发挥重要作用[41]，提示成骨细胞来源的外泌体内蛋白质可为骨形成研究提供新的前景。综上，外泌体及其蛋白质和miRNA 可增强成骨的信号分子，从而发挥促进骨再生、修复骨缺损的作用。

2.3 外泌体与破骨细胞 破骨细胞是来源于单核细胞的多核细胞，可通过分泌蛋白酶及酸性物质降解骨基质[42]。破骨细胞与成骨细胞功能相对，在骨再生中发挥重要作用。破骨细胞分化受肿瘤坏死因子（TNF）、核因子受体活化因子配体（RANKL）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）等调控[43]。外泌体可通过蛋白或miRNA 调控骨髓微环境，抑制破骨细胞活性。前列腺癌细胞外泌体通过下调破骨细胞内miR-214 和阻断NF-κB 信号传导，抑制破骨细胞分化[44]。前列腺癌细胞外泌体可降低DC-STAMP、TRAP、组织蛋白酶K 和MMP-9 等破骨细胞标志物的表达，抑制破骨细胞的增殖和分化，从而调控骨形成[45]。脂肪间充质干细胞外泌体不仅降低RANKL 的mRNA和蛋白水平，而且降低RANKL/OPG 比例，从而抑制RANKL 介导的破骨细胞分化[46]。雌激素缺乏骨质疏松模型小鼠注射内皮细胞来源的外泌体后，破骨细胞活性降低，有效抑制骨质疏松的发展[47]。此外，破骨细胞源性外泌体可作为破骨细胞与成骨细胞间的媒介，调控成骨细胞的活性和骨生成功能。成熟破骨细胞外泌体可抑制成骨细胞内Wnt/β-catenin 信号传导通路，并诱导成骨细胞凋亡，促进骨质疏松的发展[48]。破骨细胞外泌体富含miRNA，通过miRNA 抑制成骨细胞活性。破骨细胞外泌体通过ephrinA2 和EphA2 之间的相互作用特异性识别成骨细胞，并将miR-214 转移至成骨细胞内，最终导致成骨细胞功能障碍[49]。另一项实验证实，破骨细胞源性外泌体miR-214-3p 可靶向成骨细胞，在体外抑制成骨细胞活性和体内抑制骨的形成，但体内注射antagomir-214-3p 则可有效增强骨形成[50]。因此，外泌体中miR-214 或miR-214-3p 不仅可作为骨量减少的生物标志物，而且可以作为促进骨再生的治疗靶点。此外，有研究显示RANKL 可诱导破骨细胞源性外泌体内miR-23a-5p 表达，而 miR-23a-5p 可抑制Runx2 表达，促进YAP1 介导的MT1DP，从而抑制成骨细胞分化[51]。总之，外泌体可调控破骨细胞活性，介导骨再生的发展。而破骨细胞外泌体在成骨细胞功能和骨再生的调控中也发挥作用，而且其中某些特定的miRNA 可作为骨量减少等疾病的诊断标志物和治疗靶点。

2.4 外泌体与间充质干细胞 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）广泛存在于各种组织器官内，是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。MSCs 具有促进组织损伤修复和免疫调节等能力，但其机制有待明确[52]。MSCs 移植后存活的数量有限，难以通过新分化的细胞替代受损细胞达到修复组织损伤的作用，而其旁分泌作用才可能是主要机制[53]。研究证实，MSCs 分泌的外泌体具有促进皮肤愈合[54]、修复肾损伤[55]和缺血性心肌损伤[56]等作用。将MSCs 外泌体注射到股骨骨折的CD9-/-小鼠体内，可加速小鼠骨折愈合[57]。人诱导的多能干细胞的MSCs 外泌体可有效促进卵巢切除大鼠极限颅骨缺损的骨再生和血管生成，此作用随外泌体浓度的增加而增强[35]。此外，MSCs 可向成骨、成软骨等方向分化，在软骨、骨再生和修复中具有重要作用[58]。一些特定组织或细胞来源的外泌体可促进MSCs 的成骨分化，提示其在骨再生中的潜能。人脂肪干细胞外泌体可诱导人MSCs 的成骨分化、增殖和迁移，与PLGA/pDA 支架复合后可促进新骨形成，修复小鼠骨缺损[59]。树突细胞外泌体可促进人MSCs 向成骨细胞分化，并提高MSCs 内ALP 和RUNX2 表达，这可能是其促成骨分化的潜在机制[60]。此外，另有研究发现MSCs 在成骨分化的不同阶段，其外泌体miRNA的表达谱随之改变。利用微阵列分析未分化和已成骨分化的脂肪干细胞外泌体中的miRNA 表达谱，发现有 201 种 miRNA 表达上调，33 种 miRNA 表达下调，而差异表达的miRNA 可调控成骨分化。因此，通过改变外泌体miRNA 的表达可促进脂肪干细胞的成骨分化[61]。研究证实，MSCs 摄取脂肪来源干细胞外泌体后，细胞内miR-223 表达降低，从而促进MSCs 成骨分化[62]。综上表明，MSCs 外泌体在骨形成中起重要作用，可通过调控MSCs 的成骨分化促进骨再生，为骨再生的治疗提供新思路。

3 外泌体治疗优势与局限性

与细胞治疗相比，外泌体作为新的治疗策略具有多种优势。外泌体可避免因细胞移植而引起的肿瘤、移植物抗宿主病和栓子形成等并发症的发生，安全性更高[63]。与细胞疗法不同，外泌体没有异倍体风险，大大降低在同种异体给药后出现免疫排斥的可能性[64]。而与生物纳米材料相比，外泌体具有较高的生物相容性、更低的细胞毒性。此外，外泌体因优选的肿瘤归巢性、可调节的靶向效率以及穿过细胞膜或血脑屏障等能力，成为递送药物和基因的理想载体[65]。目前已有研究将阿霉素、miR-143 包裹在外泌体内，用于骨肉瘤治疗[66-67]。

然而，外泌体在骨再生的临床应用还存在诸多限制和挑战。首先，如何大量高效地从各种体液或细胞培养液中分离提纯外泌体以及运输储存是一大难题。目前外泌体提取方法主要是超速离心、免疫吸附、沉淀、微流体分离[68]。体外分离产量低，且易受到蛋白或其他胞外囊泡的污染，而储存温度、储存液pH 和冻融循环也可影响外泌体活性和靶细胞对其的摄取量[69]。其次，提高外泌体到达靶细胞的准确性也是临床应用面临的问题。大多数研究表明，外泌体在全身给药后难以达到预期的治疗效果[70]。因此，避免外泌体被巨噬细胞吞噬，并能在体内长时间循环，从而可以到达靶细胞，也是外泌体临床应用的基础。最后，保证外泌体的安全性是临床应用的前提。有研究表明，外泌体可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，促进肿瘤的生长[71]。因此，限制外泌体潜在的促肿瘤作用是必须解决的问题。

4 小 结

本文阐述了外泌体的形成、分泌及摄取的相关机制，以及外泌体作为细胞间中通讯的重要介质参与骨再生中多种细胞间的信号传导及骨再生过程。但外泌体介导骨再生的分子机制十分复杂，同时外泌体的临床应用还存在一系列需要克服的难题。目前外泌体的研究处于初级阶段，随着研究的不断深入，外泌体必有望成为骨再生领域具有良好前景的治疗策略。