葫芦素B联合奥沙利铂对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的抑制作用及其机制

冯 杰，任立群，陈素贤,万义增，徐培斌

(1.锦州医科大学基础医学院病理学与病理生理学教研室，辽宁 锦州 121000；2. 锦州医科大学附属第三医院病理科，辽宁 锦州 121000；3. 吉林大学药学院实验药理与毒理教研室，吉林 长春 130021；4. 长春中医药大学中医学教研室，吉林 长春 130117)

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，易发生远处转移，发现时多为中晚期。奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)是周期非特异性抗肿瘤药物，可抑制肿瘤细胞增殖，常用于治疗结肠癌，但长期使用会产生肾毒性、耳毒性和骨髓抑制等不良反应，降低了患者的生活质量[1]。因此，减轻OXA的不良反应，提高患者生存质量是治疗结肠癌的关键。中药对肿瘤细胞有抑制作用，因价格低廉、安全无毒，受到人们的高度关注。葫芦素B(cucurbitacin B,CUB)是葫芦素家族成员之一，一种高度氧化的四环三萜类化合物。国内外研究[2-9]显示：CUB对胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤和淋巴瘤等多种肿瘤有抑制作用。目前国内外尚无CUB联合OXA对结肠癌SW480细胞增殖的影响及机制的相关研究。本研究通过体外实验观察CUB联合OXA对结肠癌SW480细胞增殖及凋亡的影响，探讨其作用机制，为临床治疗结肠癌提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 人结肠癌SW480细胞株(吉林大学药学院提供)。CUB(南京景竹生物科技有限公司)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为1 mol·L-1，置于-20℃冰箱保存，DMSO的浓度控制在0.1%以下。OXA(江苏恒瑞医药股份有限公司)，用时现配制成100 μmol·L-1。DMEM高糖培养液(美国Hyclone公司)，优质胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，DMSO、噻唑蓝(MTT)和碘化啶(PI)(美国Sigma公司)，Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒、总蛋白提取试剂盒、细胞裂解液、ECL发光液和Hoechst33258染色液(中国碧云天公司)，半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteiyl aspartate specific protease-3， caspase-3)抗体、活化后的caspase-3(cleaved caspase-3)抗体、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗体和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗体(美国Abcam公司)，HRP标记的山羊抗兔/鼠二抗(北京鼎国昌盛公司)。倒置相差显微镜(日本尼康公司)，DG5031型酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)，电泳槽、流式细胞仪和CO2培养箱(美国SIM公司)，Tanon 4600全自动化学发光图像分析系统(上海Tanon科技有限公司)。

1.2 细胞培养和分组 SW480细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养，置于37℃、5%CO2恒温箱中培养，每2～3 d传代1次。 将细胞分为对照组,10、20和40 μmol·L-1CUB组，OXA组(100 μmol·L-1)和 联合组(40 μmol·L-1CUB + 100 μmol·L-1OXA)。

1.3 MTT法检测SW480细胞增殖率 用0.25%胰酶消化对数生长期的SW480细胞，按每孔5×103个细胞接种于96孔板中，每组设6个复孔。次日，按照实验分组加药，培养24 h，每孔加入MTT 20 μL(5 g·L-1)，继续培养4 h，每孔加入DMSO 150 μL ，摇床10 min。设调零孔，选择490 nm波长，用酶标仪测定各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验组A值/对照组A值×100%。实验重复3次。

1.4 Hoechst33258染色法观察SW480细胞形态表现 将对数生长期的结肠癌SW480细胞接种于6孔板中，分组同上，每孔4×105个细胞。加药培养24 h，PBS洗3遍；加入10%甲醛4℃固定15 min；加入Hoechst33258染色液，室温孵育2 min；封片后用荧光显微镜观察细胞形态表现，Images Advanced 3.2成像系统处理图片。实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测SW480细胞周期和细胞凋亡率 将对数生长期的结肠癌SW480细胞接种于6孔板中，分组同上，每孔4×105个细胞。加药培养24 h后收集细胞，1 000 g离心5 min；1 mL PBS洗涤后，加入1.0 mL 70%乙醇溶液4℃固定过夜；1 000 g离心5 min，预冷PBS洗2遍；加入0.6 mL PI染液，避光孵育30 min，在1 h内上流式细胞仪检测不同细胞周期细胞百分率。实验重复3次。

细胞分组同上。培养24 h后收集细胞，1 000 g 离心5 min，弃培养液，按照Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。在室温下避光孵育10 min，在30 min内采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。

1.6 Western blotting法检测SW480细胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平 按照1.5进行分组和加药，24 h后提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳，统一蛋白上样量30 μg，转移至PVDF膜上；封闭液封闭1 h，加一抗4℃过夜；次日加HRP标记的二抗，摇床1 h，TBST缓冲液20 min/次洗3次，加ECL发光液，实验重复3次。通过Tanon 4600全自动化学发光图像分析系统显影拍摄照片，用Image Pro Plus 6.0软件分析caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的灰度值,以GAPDH为内参对照，计算蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组SW480细胞增殖率 与对照组比较，不同剂量CUB组、OXA组和联合组SW480细胞增殖率明显降低(P<0.05)；与不同剂量CUB组和OXA组比较，联合组细胞增殖率进一步降低(P<0.05)。见表1。

2.2 各组SW480细胞形态表现 Hoechst33258染色后观察SW480细胞形态表现：对照组细胞的细胞核蓝色荧光分布均匀；CUB组和OXA组细胞蓝色荧光较对照组亮，细胞核可见浓染致密的颗粒块状荧光；与CUB组和OXA组比较，联合组细胞蓝色荧光更亮，细胞核浓染颗粒更明显。见图1(插页五)。

A:Control group; B-D: 10,20， and 40 μmol·L-1CUB groups; E: OXA group; F: Combination group.
图1 各组SW480细胞形态表现 (Hoechst 33258,×200)
Fig.1 Morphology of SW480 cells in various groups(Hoechst 33258,×200)

表1 各组SW480细胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of SW480 cells in various groups

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group;#P<0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group;○P<0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group;□P<0.05 compared with OXA group.

2.3 各组不同细胞周期SW480细胞百分率 与对照组比较，不同剂量CUB组和联合组G2/M期细胞百分率明显升高(P<0.05)，OXA组、40 μmol·L-1CUB组和联合组S期细胞百分率明显升高(P<0.05)。见图2(插页六)和表2。

A:Control group; B-D:10，20，and 40 μmol·L-1CUB groups; E: OXA group; F: Combination group.
图2 流式细胞术检测各组不同细胞周期SW480细胞百分率
Fig.2 Percentages of SW480 cells in different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

表2 各组不同细胞周期SW480细胞百分率Tab.2 Percentages of SW480 cells in different cell cycles in various groups

*P<0.05 compared with control group.

2.4 各组SW480细胞凋亡率 与对照组比较，不同剂量CUB组、OXA组和联合组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与不同剂量CUB组和OXA组比较，联合组细胞凋亡率进一步升高(P<0.05)。见图3和表3。

A:Control group; B-D: 10，20，and 40 μmol·L-1 CUB groups; E: OXA group; F: Combination group.图3 流式细胞术检测各组SW480细胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups detected by flow cytometry

表3 各组SW480细胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group;#P<0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group;○P<0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group;□P<0.05 compared with OXA group.

2.5 各组SW480细胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达水平及cleaved caspase-3/caspase-3和Bcl-2/Bax 比值 与对照组比较，不同剂量CUB组、OXA组和联合组SW480细胞中caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax 比值明显降低(P<0.05)，cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平及cleaved caspase-3/caspase-3比值明显升高(P<0.05)；与不同剂量CUB组和OXA组比较，联合组细胞中caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比值明显降低(P<0.05)，cleaved caspase-3和Bax 蛋白表达水平及cleaved caspase-3/caspase-3比值明显升高(P<0.05)。见图4和表4。

Lane 1: Control group; Lane 2-4: 10,20,and 40 μmol·L-1CUB groups; Lane 5: OXA group; Lane 6: Combination group.
图4 各组SW480细胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达电泳图
Fig.4 Electrophoregram of expressions of caspase-3, cleaved caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins in SW480 cells in various groups

3 讨 论

细胞凋亡是由基因控制的一种自主性死亡，肿瘤细胞的无限增殖使得肿瘤细胞无法凋亡。因此，治疗结肠癌的关键是抑制结肠癌细胞增殖，促进结肠癌细胞凋亡。OXA是治疗结肠癌的常用化疗药物，但不良反应明显，降低了患者的生存质量。因此，寻找高效低毒、增强药物疗效及减轻药物不良反应的新药物极其重要。CUB是广泛存在于葫芦科植物中的一类四环三萜类化合物，具有多种药理作用，如抗病毒、抗炎、抑制细胞生长和降血糖等[10]，对肿瘤细胞的促凋亡作用引起人们的密切关注。本研究采用不同浓度CUB、OXA及CUB联合OXA作用于人结肠癌SW480细胞，MTT法检测结果显示：与对照组比较，各加药组细胞增殖率明显降低，提示CUB、OXA及两药联合能够诱导细胞凋亡；流式细胞术检测结果显示：与对照组比较，各加药组细胞凋亡率升高，且联合组细胞凋亡率明显高于CUB组和OXA组。研究[11]显示：CUB可将乳腺癌细胞阻滞在S期和G2/M期，诱导细胞凋亡，且能增加药物对细胞的灵敏性。本研究采用流式细胞术检测SW480细胞周期分布，结果显示：与对照组比较，CUB组和联合组细胞中S期和G2/M期细胞百分率升高，OXA组细胞中S期细胞百分率升高。

表4 各组SW480细胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达水平及cleaved caspase-3/caspase-3和Bcl-2/Bax 比值Tab.4 Expression levels of caspase-3,cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax proteins in SW480 cells and ratios of cleaved caspase-3/caspase-3 and Bcl-2/Bax in various groups

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group;#P<0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group;○P<0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group;□P<0.05 compared with OXA group.

Bcl-2家族在细胞凋亡中起重要作用，其中Bcl-2基因抑制肿瘤细胞凋亡，Bax基因促进肿瘤细胞凋亡；Bcl-2与Bax既可形成同源二聚体也可形成异源二聚体。当Bcl-2水平升高时，抑制细胞凋亡；Bax水平升高时，促进细胞凋亡[12-13]。有研究[14]显示：结肠癌细胞中Bcl-2表达水平升高，Bcl-2升高抑制Bax表达，进而抑制细胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinylaspartate specific protease，caspase)在细胞凋亡中起促进作用[15]，其中caspase-3在细胞凋亡过程中是最关键的执行者，是caspase家族中的重要成员[16-17]。细胞凋亡分为受体依赖性途径和线粒体途径[18]；当线粒体受刺激时，如感染和DNA损伤，线粒体膜通透性增加，细胞色素C将通过线粒体膜进入细胞质，与凋亡酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)结合，激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific protease-9，caspase-9)，caspase-9活化下游的无活性的caspase-3，激活caspase-3剪切成有活性的cleaved caspase-3，进一步激活caspase的级联反应，诱导细胞凋亡[19-20]。Bcl-2家族可调控caspase的活化和灭活[21]。本研究采用Western blotting法检测各组SW480细胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达水平，结果显示：与对照组比较，各加药组caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平降低，cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平升高；与CUB组和OXA组比较，联合组细胞中上述蛋白表达水平变化更加明显，提示CUB可以促进cleaved caspase-3和Bax蛋白表达，抑制caspase-3和Bcl-2蛋白表达，上调cleaved caspase-3/caspase-3比值，下调Bcl-2/Bax比值，诱导SW480细胞凋亡。

综上所述， CUB能够抑制结肠癌SW480细胞增殖，CUB联合OXA抑制作用更加明显。CUB联合OXA的具体抗肿瘤机制还有待后续研究，且联合用药在动物体内是否具有抑癌作用还有待进一步研究。